Марина тихонова 86: найти риэлтора, агента по недвижимости в базе: список

Содержание

МБОУ г.Кургана «СОШ № 9» Курганской обла

 

Ивачева Наталья Петровна.

Заместитель директора по УВР, учитель французского языка высшей квалификационной категории.

Награждена грамотами Министерства образования и науки РФ, Департамента социальной политики Администрации города Кургана, имеет Благодарственное письмо Курганской областной Думы.

Высшее педагогическое образование.

Повышение квалификации: «Подготовка экспертов по вопросам государственного контроля  в области образования, лицензионного контроля и проведения государственной аккредитации ОУ», 72 часа, ИРОСТ, 2011. «Компетентностный подход в обучении иностранным языкам». 72 часа, ИРОСТ, 2011. Диплом ИРОСТ по программе «Менеджмент в образовании», 2013. Проверка знаний требований охраны труда по программе для ЧК в объеме 40 часов, Учебный центр профсоюзов, 2014.

Общий педагогический стаж — 30 лет, в должности заместителя директора по УВР — 14 лет. 

 

Семкина Людмила Николаевна.

Учитель немецкого языка первой квалификационной категории.

Имеет Благодарственное письмо ГлавУО Курганской области.

Высшее педагогическое образование. 

Повышение квалификации: «Информационные технологии в преподавании иностранных языков в средних общеобразовательных учреждениях», 72 часа., КГУ, 2012.

Общий педагогический стаж — 26 лет.

 

Тихонова Марина Иосифовна

Учитель английского языка первой квалификационной категории.

Награждена грамотой Департамента социальной политики Администрации города Кургана, имеет Благодарственное письмо ДОиН Курганской области.

Высшее педагогическое образование.

Повышение квалификации: Проектирование содержания иноязычного образования обучающихся в контексте подготовки к итоговой аттестации, 72 часа, ИРОСТ, 2015.

Общий педагогический стаж — 11 лет.

 

Фалева Светлана Владимировна 

Учитель английского языка, соответствие занимаемой должности.

Высшее педагогическое образование.

Повышение квалификации: Современные образовательные технологии в преподавании иностранных языков как условие повышения качества образования, 72 часа, ИРОСТ, 2015.

Общий педагогический стаж — 4 года.

 

Сизова Юлия Сергеевна

Учитель английского языка.

Высшее педагогическое образование.

Повышение квалификации: «Урок иностранного языка в контексте внедрения ФГОС», 72 часа, ИРОСТ.

Общий педагогический стаж — 2 года.

 

Марина Тихонова Модель | Россия

ФИО

Марина Васильевна Тихонова

Возраст

32 года

Модель

Специалист

Танцор

Базово

Страна

Россия

Условия работы

Срок подписания

Приду на кастинг

Готовность к переезду

Нет

Загран паспорт

Есть

Телосложение

Стройное

Обхват груди

85 см

Обхват талии

60 см

Обхват бёдер

86 см

Размер обуви

38

Размер одежды

XS

Тип внешности

Цвет глаз

Голубой

Длина волос

Ниже лопаток

Цвет волос

Русый

Татуировки

Несколько скрытых

Пирсинг

Несколько скрытых

О себе

Я довольно увлеченный человек, зажигающийся как спичка, если меня что-то очень заинтересует, отдамся этому полностью. Целеустремленная, активная, мега энергичная и обожаю людей и жизнь. Не приемлю аморальные вещи,такое же отношение к природе, детям, животным, не люблю неискрееность в люях, делах, поступках. За мир во всем мире!

Хобби / увлечения

Обожаю готовить, люблю классическую литературау и психологию ХХ веков. Как мне кажется, довольно не плохо танцую (есть опыт работы танцевальных выступлений), жить не могу не путешествуя и бесконечно много готова проводить время за плаванием.

Образование

2010

Москва Университет МГУТУ им.Разумовского

Специальность: Экономист

Преподаватель:

Опыт / Фильмография

Ссылка на эту анкету: https://www.acmodasi.ru/a_258101.html
Дата регистрации: 18 Марта 2015 14:39
Дата обновления: 18 Марта 2015 14:49
Был на сайте: 6 лет назад
Просмотров: 491
Комментариев: 1
Популярность: 1

Отдел социальной поддержки населения Кировского района

Порядок награждения Дипломом мэрии города Новосибирска многодетной матери женщин, воспитавших четырех или более детей

Порядок награждения знаком почета «За материнскую доблесть» многодетных матерей, воспитавших пять или более детей.

Об утверждении Порядка назначения и выплаты ежемесячной денежной выплаты отдельным категориям граждан, проживающим в городе Новосибирске

Постановление об утверждени порядка назначения и выплаты единовременной материальной помощи при рождении детей

Административный регламент предоставления муниципальной услуги по назначению и выплате единовременной материальной помощи при рождении детей

Административный регламента предоставления муниципальной услуги по назначению и выплате ежемесячной денежной выплаты отдельным категориям граждан

Порядок оформления и выдачи микропроцессорной пластиковой карты

Постановление об утверждении положения о микропроцессорной пластиковой карте от 29. 10.2007г. № 422

Постановление о мерах социальной поддержки отдельных категорий граждан при проезде на городском общественном пассажирском транспорте

Об утверждении Порядка назначения и выплаты ежемесячной денежной выплаты отдельным категориям граждан, проживающим в городе Новосибирске

ИЩУ МАМУ — Городская социальная программа

СПб ОБФ «Родительский Мост»

Ул. Моховая, д. 30
Ответственный за ШПР: Михалина Ирина Андреевна
+7 (901) 316-16-69
[email protected]

СПб ГБУ «Центр содействия семейному воспитанию № 6»

Ул. Счастливая, д.6
Ответственный за ШПР: Забелина Оксана Яковлевна
+7 (812) 417-52-34
[email protected] ru
[email protected]

Епархиальная школа приемных родителей «Умиление»

наб. реки Монастырки, д. 1
Ответственный за ШПР: Надежда Михайловна Амбарцумова
+7(911) 707-07-79
[email protected]

СПб ГБУ «Центр содействия семейному воспитанию № 14»

г. Пушкин, улица Ленинградская, дом 53 а, лит.А
Ответственный за ШПР: Бухтиярова Галина Александровна
+7(812) 573-98-85
[email protected]

СПб ГБУ «Центр содействия семейному воспитанию № 15»

ул. Бухарестская, д. 63
Ответственный за ШПР: Игнатьева Наталья Владимировна
+7 (812)772-46-53, 417-28-71
[email protected]

СПб ГБУ «Центр содействия семейному воспитанию № 9»

Колпино, ул. Адмиралтейская, д. 5
Ответственный за ШПР: Цапова Светлана Валерьевна
+7 (812) 461-00-90
[email protected]
[email protected]

СПб ГКУЗ «Специализированный Дом ребенка № 3»

Загребский бульвар, д. 42
Ответственный за ШПР: Крюкова Елена Юрьевна
+7 (812)241-56-30
[email protected]

СПб ГБУСОН «Социально-реабилитационный центр для несовершеннолетних «Дом милосердия»

14-я линия Васильевского Острова, дом 25/27
Ответственный за ШПР: Широкова Ксения Павловна
+7 (812) 246-09-91
[email protected]

СПб ГБУ «Центр содействия семейному воспитанию № 5»

ул. Ушинского, д. 17, корп. 2, литер А.
Ответственный за ШПР: Сёмина Елена Анатольевна
+7 (812) 590-13-40
ddomik3.
[email protected] [email protected]

в Галерее Марины Гисич | Галерея современного искусства

ПРОЕКТ «СЛЕПКИ»

Научно-исследовательский Музей РАХ, Санкт-Петербург.

Деление на традиционное и современное искусство дополняет перечень дихотомий, больше связанных внутри, нежели разобщенных. Однако следует задать вопрос, что значит эта раздвоенность искусства с точки зрения художника, музея, зрителя?

Проект «Слепки» представляет собой попытку напомнить, что современное искусство не всегда противостоит традициям, а скорее обращается к вечной гавани классических образцов, которая уже давно стала базой образов. Художники, представленные на экспозиции, по-своему отталкиваются от идей, в этой базе заложенных: соглашаются с ними, отрицают, оспаривают или пересобирают их. Выставка становится поводом по-новому взглянуть на восприятие классики современным зрителем. Насколько в настоящее время мы считываем первоначальные смыслы или же только довольствуемся визуальным впечатлением и воспринимаем искусство древности исходя из представления об эстетическом удовольствии? Проект скорее задает вопросы, нежели отвечает на них: как произведение искусства попадает в историю, можем ли мы утверждать, что оригинал более ценен, чем копия и какие отношения между современностью и традицией — является ли современное искусство лишь копией классического оригинала? Выставка в своей структуре воплощает сразу два подхода к истории: линейную классическую интерпретацию, выраженную в экспозиции Музея, и множество анахронических историй современности, которые рассредоточены по пространству Музея и обращаются, реагируют на стоящие рядом слепки.

Участники выставки: Марина Алексеева (при участии Сергея Карлова), Людмила Белова, Вячеслав Беречинский, Иван Говорков, Алексей Грачев, Елена Губанова, Анастасия Жихарцева, Павел Игнатьев, Виктория Илюшкина и Майя Попова, Владимир Козин, Лера Кузнецова, Светлана Михайлова, Влад Молчан, Константин Новиков, Виктор Педдерсон, Донато Пикколо, Иван Плющ, Виталий Пушницкий, Марина Стахиева, Алена Терешко, Наталья Тихонова, Ольга Тобрелутс, Анна Франц, Георгий Хазанкин, Леонид Цхе, Татьяна Черномордова, Петр Швецов, Александр Шишкин-Хокусай

Управление экономического развития

Ильинский Александр Александрович

Начальник управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 13

Королев Владимир Анатольевич

Заместитель начальника управления экономического развития

ул. Советская, 112, каб. 13

Сидоренко Марина Владимировна

главный специалист-эксперт управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 5

Отдел мелкорозничной торговли

Грачев Олег Вячеславович

Заместитель начальника управления — начальник отдела мелкорозничной торговли управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 3

Капелюха Людмила Марковна

Главный специалист-эксперт отдела мелкорозничной торговли управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 11

Горбунова Галина Александровна

Консультант отдела мелкорозничной торговли управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 3

Козлов Андрей Евгеньевич

Референт отдела мелкорозничной торговли управления экономического развития

ул. Советская, 112, каб. 3

Кузнецов Павел Александрович

Консультант отдела мелкорозничной торговли управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 3

Иванов Михаил Игоревич

Референт отдела мелкорозничной торговли управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 3

Моисеева Ирина Владимировна

Референт отдела мелкорозничной торговли управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 3

Анисимова Алена Андреевна

Референт отдела мелкорозничной торговли управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 10

Отдел налоговой политики и трудовых отношений

Радин Михаил Александрович

Начальник отдела налоговой политики и трудовых отношений управления экономического развития

ул. Советская, 112, каб. 12

Лысикова Елена Алексеевна

Референт отдела налоговой политики и трудовых отношений управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 12

Виторская Любовь Васильевна

Референт отдела налоговой политики и трудовых отношений управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 12

Савина Татьяна Владимировна

Главный специалист-эксперт отдела налоговой политики и трудовых отношений управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 12

Тихонова Марина Петровна

Референт отдела налоговой политики и трудовых отношений управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 12

Лукашина Наталья Васильевна

Главный специалист-эксперт отдела налоговой политики и трудовых отношений управления экономического развития

ул. Советская, 112, каб. 12

Отдел развития инвестиционной политики, предпринимательства и внешнеэкономических связей

Михайлов Валентин Сергеевич

Начальник отдела развития инвестиционной политики, предпринимательства и внешнеэкономических связей управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 13

Пынько Илья Владимирович

Референт отдела развития инвестиционной политики, предпринимательства и внешнеэкономических связей управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 16

Карасев Антон Константинович

Консультант отдела развития инвестиционной политики, предпринимательства и внешнеэкономических связей управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 14

Калгина Елена Анатольевна

Референт отдела развития инвестиционной политики, предпринимательства и внешнеэкономических связей управления экономического развития

ул. Советская, 112, каб. 14

Ярыгина Людмила Сергеевна

Главный инструктор-специалист отдела развития инвестиционной политики, предпринимательства и внешнеэкономических связей управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 16

Освальд Максим Федорович

Референт отдела развития инвестиционной политики, предпринимательства и внешнеэкономических связей управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 16

Маричева Валерия Алексеевна

Референт отдела развития инвестиционной политики, предпринимательства и внешнеэкономических связей управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 16

Нестерова Маргарита Сергеевна

Консультант отдела развития инвестиционной политики, предпринимательства и внешнеэкономических связей управления экономического развития

ул. Советская, 112, каб. 14

Отдел регулирования потребительского рынка

Дегтярев Николай Львович

Главный специалист отдела регулирования потребительского рынка управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 8

Казаков Иван Валериевич

Главный специалист-эксперт отдела регулирования потребительского рынка управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 8

Сектор сельского хозяйства

Толкунов Николай Николаевич

начальник сектора сельского хозяйства управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 2

Заводов Анатолий Анатольевич 

референт сектора сельского хозяйства управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 2

Сагдиев Лев Игоревич

Референт сектора сельского хозяйства управления экономического развития

ул. Советская, 112, каб. 2

Сектор социально-экономического анализа и стратегического планирования

Холодов Александр Анатольевич

Начальник сектора социально-экономического анализа и стратегического планирования управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 1

Быкова Валентина Ивановна

Референт сектора социально-экономического анализа и стратегического планирования управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 1

Макешина Ирина Евгеньевна

Референт сектора социально-экономического анализа и стратегического планирования управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 1

Ященко Лилия Ивановна

Главный специалист-эксперт сектора социально-экономического анализа и стратегического планирования управления экономического развития

ул. Советская, 112, каб. 15

Сектор учета и отчетности

Потапова Любовь Владиславовна

Начальник сектора учета и отчетности управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 7

Ястребова Наталия Михайловна

Референт сектора учета и отчетности управления экономического развития

ул.Советская, 112, каб. 7


Приказ от 21.12.2020 № 34 «О внесении изменений в приказ от 17.06.2015 № 45 «Об утверждении учетной политики для целей бухгалтерского учета управления экономического развития администрации города Тулы»

Приказ от 22.10.2020 № 28 «О внесении изменений в приказ от 28.06.2016 № 84 «Об утверждении Порядка признания безнадежной к взысканию задолженности по платежам в бюджет муниципального образования город Тула по неналоговым доходам в управлении…»

Приказ от 15.07.2020 № 18 «О внесении изменений в приказ управления экономического развития администрации города Тулы от 17. 06.2015 г. № 45 «Об утверждении учетной политики для целей бухгалтерского учета управления экономического развития администрации го

Приказ от 22.04.2020 № 6 «О внесении изменений в приказ управления экономического развития администрации города Тулы от 17.06.2015 г. № 45 «Об утверждении учетной политики для целей бухгалтерского учета управления экономического развития администрации…»

Приказ от 15.04.2020 № 8 «О внесении изменений в приказ управления экономического развития администрации города Тулы от 27.07.2016 г. № 89 «Об утверждении Методики прогнозирования неналоговых доходов бюджета муниципального образования город Тула…»

Приказ от 26.12.2019 № 47 «О внесении изменений в приказ управления экономического развития администрации города Тулы от 17.06.2015 г. № 45 «Об утверждении учетной политики для целей бухгалтерского учета управления экономического развития…»

Приказ от 30.10.2018 № 33 «О внесении изменений в приказ управления экономического развития администрации города Тулы от 17. 06.2015 г. № 45 «Об утверждении учетной политики для целей бухгалтерского учета управления экономического развития…»

Приказ от 27.07.2016 № 89 «Об утверждении Методики прогнозирования неналоговых доходов бюджета муниципального образования город Тула в управлении экономического развития администрации города Тулы»

«Тальцы» — архитектурно-этнографический музей

Директор: Тихонов Владимир Викторович

Кандидат культурологии

Руководитель методического центра Сибири и Дальнего Востока по проблемам музеев под открытым небом

Телефон: (3952) 24-31-58

E-mail: [email protected]

Заместитель директора по научно-методической работе: Колганова Елена Юрьевна

Кандидат культурологии

Телефон: (3952) 20-41-85

Заместитель директора по административно-хозяйственной части: 

Бородаев Виктор Александрович

Телефон:(3952) 24-31-82, 679-683

Заместитель директора по организационно-массовой работе

Стрекалина Елена Анатольевна

Телефон: 8-950-145-40-75

E-mail: strekalina. [email protected] 

Ученый секретарь: Лыхин Юрий Петрович

Телефон: (3952) 24-31-82

E-mail: [email protected]

Главный хранитель: Ометова Марина Леонидовна

Телефон: (3952) 35-64-01

E-mail: [email protected]    

Главный бухгалтер: Земляничкина Людмила Ивановна

Телефон: (3952) 24-33-21

E-mail: [email protected] 

Юрисконсульт: Алтынбаева Анна Владимировна

Телефон: (3952) 24-32-91

E-mail: [email protected]

Отдел организации экскурсионного обслуживания и культурно просветительных мероприятий.

Сектор КБЖД 80 км.

Сектор Пихтинск.

Заместитель директора по организационно-массовой работе: Стрекалина Елена Анатольевна

Телефон: 8-950-145-40-75, Е-mail: [email protected] 

Лекторы-экскурсоводы:

Зверева Виктория Леонидовна  
Верхотурова Ирина Викторовна  
Керусова Елена Валентиновна  
Шолохова Любовь Вячеславовна  

Специалисты по маркетингу:

Караулова Лариса Леонидовна  
Шайхова Александра Вячеславовна 
Бутакова Марина Геннадьевна  

Отдел хранения музейных предметов и коллекций

Хранители музейных предметов:

Логинов Михаил Алексеевич  

Логинова Надежда Владимировна

 Бородаева Ирина Леонидовна

Специалисты по учету музейных предметов:

Малыхина Елена Алексеевна 

Сечейко Ольга Юрьевна 

Реставраторы:

Хромешкина Марина Павловна  

Тихонова Мария Алексеевна  

Давыдов Роман Аркадьевич  

Отдел научного строительства экспозиций и выставок, музейных программ и проектов

Агапитова Римма Валентиновна — главный научный сотрудник

 

 

 

 

 

 

 

Кужман Анастасия Владимировна — старший научный сотрудник

Отдел бухгалтерского учета, контроля и финансово-экономического анализа

Земляничкина Людмила Ивановна – главный бухгалтер

Производственно-хозяйственный цех

Начальник цеха: Кириленко Елена Николаевна

Телефон: 8-950-112-71-03

Транспортный цех

Начальник цеха: Комышев Антон Николаевич

Служба безопасности

Главный сотрудник службы безопасности: Бочаров Олег Николаевич

Телефон: 8-950-099-65-86

Ведущий специалист по кадрам

Умпелева Ирина Николаевна

Дендритные клетки, созданные в присутствии интерферона-α и модулированные дексаметазоном в качестве новой толерогенной платформы вакцины

  • Chamorro S (2009) Запуск TLR на толерогенных дендритных клетках приводит к усилению регуляции TLR2 и снижению провоспалительной иммунной программы.J Immunol 183: 2984–2994

    CAS Статья Google ученый

  • Della Bella S, Nicola S, Riva A, Biasin M, Clerici M, Villa M (2004) Функциональный репертуар дендритных клеток, генерируемых в гранулоцитарном макрофагально-колониестимулирующем факторе и интерфероне-альфа. J Leukoc Biol 75: 106–116

    CAS Статья Google ученый

  • Franzke A, Piao W, Lauber J, Gatzlaff P, Könecke C, Hansen W., Schmitt-Thomsen A, Hertenstein B, Buer J, Ganser A (2003) G-CSF как иммунный регулятор в Т-клетках, экспрессирующих G -CSF рецептор: значение для трансплантации и аутоиммунных заболеваний. Кровь 102 (2): 734–739

    CAS Статья Google ученый

  • Гарсия-Гонсалес П., Моралес Р., Ойос Л., Магги Дж., Кампос Дж., Пеше Б. , Гарате Д., Ларрондо М., Гонсалес Р., Сото Л., Рамос В., Тобар П., Молина М.С., Пино-Лагос К., Catalán D, Aguillyn JC (2013) Короткий протокол с использованием дексаметазона и монофосфориллипида A генерирует толерогенные дендритные клетки, которые проявляют мощную миграционную способность к лимфоидным хемокинам.J Transl Med 11: 128. https://doi.org/10.1186/1479-5876-11-128

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • Gessani S, Conti L, Del Cornt M, Belardelli F (2014) Интерфероны типа I как регуляторы функций антигенпрезентирующих клеток человека. Токсины (Базель) 6: 1696–1723

    Статья Google ученый

  • Gordon J, Ma Y, Churchman L, Gordon S, Dawicki W (2014) Регулирующие дендритные клетки для иммунотерапии иммунологических заболеваний. Фронт Иммунол 5: 7. https://doi.org/10.3389/fimmu.2014.00007

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • Gottenberg J, Chiocchia G (2007) Дендритные клетки и интерферон-опосредованный аутоиммунитет. Biochimie 89: 856–871

    CAS Статья Google ученый

  • Гарри Р., Андерсон А., Айзекс Дж., Хилкенс С. (2010) Создание и характеристика терапевтических толерогенных дендритных клеток при ревматоидном артрите.Ann Rheum Dis 69: 2042–2050

    CAS Статья Google ученый

  • Hartung T, Docke W, Gantner F, Krieger G, Sauer A, Stevens P, Volk H, Wendel A (1995) Влияние лечения гранулоцитарным колониестимулирующим фактором на цитокиновый ответ ex vivo крови у людей-добровольцев. Кровь 85: 2482–2489

    CAS Статья Google ученый

  • Hilkens C, Isaacs J (2010) Толерогенные дендритные клетки в клинической практике.Открытый артрит J 3: 8–12

    CAS Статья Google ученый

  • Hilkens C, Isaacs J, Thomson A (2010) Разработка иммунотерапии на основе дендритных клеток для аутоиммунитета. Int Rev Immunol 29: 156–183

    CAS Статья Google ученый

  • Hubo M, Trinschek B, Kryczanowsky F, Tuettenberg A, Steinbrink K, Jonuleit H (2013) Костимулирующие молекулы на иммуногенных и толерогенных дендритных клетках человека.Фронт Иммунол 4:82. https://doi.org/10.3389/fimmu.2013.00082

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • Курочкина Ю., Леплина О., Тихонова М., Тыринова Т., Баторов Е., Сизиков А., Останин А., Черных Е. (2016) Влияние дексаметазона на индуцированную интерфероном-α дифференцировку моноцитов в дендритные клетки. Med Immunol 18 (4): 347–356. https://doi.org/10.15789/1563-0625-2016-4-347-356

    Статья Google ученый

  • Manoharan I, Hong Y, Suryawanshi A, Angus-Hill M, Sun Z, Mellor AL, Munn D, Manicassamy S (2014) TLR2-зависимая активация пути β-катенина в дендритных клетках вызывает регуляторные ответы и ослабляет аутоиммунные воспаление.J Immunol 193 (8): 4203–4213. https://doi.org/10.4049/jimmunol. 1400614

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • Matasić R, Dietz A, Vuk-Pavlovic S (1999) Дексаметазон подавляет созревание дендритных клеток, перенаправляя дифференцировку подмножества клеток. J Leukoc Biol. 66: 909–914

    Статья Google ученый

  • Morris E, MacDonald K, Rowe V, Johnson D, Banovic T, Clouston A, Hill G (2004) Лечение доноров пегилированным G-CSF увеличивает образование регуляторных Т-клеток, продуцирующих IL-10, и способствует переносимости трансплантации .Кровь 103: 3573–3581

    CAS Статья Google ученый

  • Naranjo-Gymez M, Raпch-Reguй D, Onate C, Grau-Lypez L, Ramo-Tello C, Pujol-Borrell R, Martнnez-Cáceres E, Borras FE (2011) Сравнительное исследование толерогенного дендрита человека клинической степени клетки. J Transl Med 9:89

    Статья Google ученый

  • Osorio F, Fuentes C, Lypez MN, Salazar-Onfray F, Gonzalez FE (2015) Роль дендритных клеток в индукции толерантности к лимфоцитам.Фронт Иммунол 6: 535. https://doi.org/10.3389/fimmu.2015.00535.eCollection

    Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

  • Paquette R, Hsu N, Kiertscher S, Park A, Tran L, Roth M, Glaspy J (1998) Интерферон-альфа и колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов дифференцируют моноциты периферической крови в мощные антигенпрезентирующие клетки. J Leukoc Biol 64: 358–367

    CAS Статья Google ученый

  • Rea D, van Kooten C, van Meijgaarden K, Melief Offringa R (2000) Глюкокортикоиды трансформируют запуск дендритных клеток CD40 в альтернативный путь активации, приводящий к появлению антигенпрезентирующих клеток, которые секретируют IL-10. Кровь 95: 3162–3167

    CAS Статья Google ученый

  • Розкова Д., Хорват Р., Бартункова Дж., Списек Р. (2006) Глюкокортикоиды серьезно нарушают дифференцировку и антигенпредставляющую функцию дендритных клеток, несмотря на повышающую регуляцию Toll-подобных рецепторов. Clin Immunol 120: 260–271

    CAS Статья Google ученый

  • Сагив-Барфи И., Червински Д., Леви С., Алам И., Майер А., Гамбхир С., Леви Р. (2018) Искоренение спонтанных злокачественных новообразований с помощью местной иммунотерапии. Sci Transl Med 10: eaan4488

    Статья Google ученый

  • Santini S, Lapenta C, Logozzi M, Parlato S, Spada M, di Pucchio T, Belardelli F (2000) Интерферон типа I как мощный адъювант для развития и активности моноцитарных дендритных клеток in vitro и в организме человека. PBL-SCID мыши.J Exp Med 191: 1777–1788

    CAS Статья Google ученый

  • Thurner B, Röder C, Dieckmann D, Heuer M, Kruse M, Glaser A, Keikavoussi P, Kämpgen E, Bender A, Schuler G (1999) Создание большого количества полностью зрелых и стабильных дендритных клеток из продуктов лейкафереза для клинического применения.J Immunol Methods 223: 1–15

    CAS Статья Google ученый

  • Укё Н., Хори Т., Янагита С., Исикава Т., Учияма Т. (2003) Костимуляция посредством OX40 имеет решающее значение для индукции аллореактивного ответа Т-клеток человека. Иммунология 109 (2): 226–231

    CAS Статья Google ученый

  • Валенте Дж., Александр Дж., Ли Б., Ноэль Дж., Кастер Д., Огл Дж., Огл С. (2002) Влияние инфузии in vivo колониестимулирующего фактора гранулоцитов на иммунную функцию. Shock 17: 23–29

    Статья Google ученый

  • Ван Кутен С., Стакс А., Вольтман А., Гельдерман К. (2009) Справочник по экспериментальной фармакологии «дендритные клетки»: использование дексаметазона в индукции толерогенных ДК.Handb Exp Pharmacol 188: 233–249. https://doi. org/10.1007/978-3-540-71029-5-11

    Артикул Google ученый

  • Woltman A, Vander Kooij S, De Fijter J, van Kooten C (2006) Устойчивые к созреванию дендритные клетки вызывают гипореактивность в аллореактивных популяциях Т-клеток CD45RA + и CD45RO + . Am J Transplant 6: 2580–2591

    CAS Статья Google ученый

  • Xia CQ, Peng R, Beato F, Clare-Salzler M (2005) Дексаметазон индуцирует продуцирующие IL-10 дендритные клетки, полученные из моноцитов, с длительной незрелостью.Scand J Immunol 62: 45–54

    CAS Статья Google ученый

  • Мезенхимальные стромальные клетки улучшают раннее восстановление лимфоцитов и восстановление Т-лимфоцитов после трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток у пациентов со злокачественными лимфомами

    Основные моменты

    Мы оцениваем мезенхимальные клетки после инфузии стромальных клеток AH со- .

    МСК наиболее эффективно улучшают восстановление лимфоцитов после инфузии трансплантата с низким числом клеток.

    МСК улучшают восстановление памяти и наивные Т-клетки, например недавние тимусные эмигранты.

    Данные указывают на положительное влияние МСК на восстановление иммунитета после АТГСК.

    Abstract

    Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) обладают многопрофильным потенциалом и иммунорегуляторной активностью и обеспечивают большой потенциал в клеточных технологиях. Однако подавляющая активность МСК вызывает опасения относительно возможного неблагоприятного воздействия МСК на восстановление иммунитета.Было охарактеризовано влияние совместной трансплантации аутологичных МСК на восстановление субпопуляций Т-клеток у пациентов, получавших аутологичную трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток (AHSCT) по поводу злокачественных лимфом и множественной миеломы. Совместная трансплантация МСК улучшала восстановление лимфоцитов наиболее эффективно у пациентов с низким поступлением гемопоэтических стволовых клеток или низким абсолютным количеством лимфоцитов в продукте афереза. Совместная трансплантация МСК улучшила раннее восстановление как памяти, так и наивных Т-клеток с более выраженным эффектом на наивные CD4 + Т-клетки.Пациенты с совместной трансплантацией МСК показали более эффективное восстановление недавних эмигрантов из тимуса. Эти данные указывают на положительное влияние МСК на восстановление иммунитета и отмечают, что совместная трансплантация МСК возможна для оптимизации результатов АТГСК у пациентов со злокачественной лимфомой.

    Ключевые слова

    Мезенхимальные стромальные клетки

    Трансплантация аутологичных гемопоэтических стволовых клеток

    Злокачественные лимфомы

    Восстановление иммунной системы

    Гомеостатическая пролиферация

    Рекомендуемые статьи © Else (полный текст)

    Inc. Все права защищены.

    Рекомендуемые статьи

    Цитирующие статьи

    Дендритные клетки, генерируемые в присутствии интерферона-α и модулированные дексаметазоном в качестве новой платформы толерогенной вакцины., Inflammopharmacology

    Предпосылки

    Толерогенные дендритные клетки (tDC) считаются новым терапевтическим инструментом в лечении аутоиммунных заболеваний, аллергии и реакций трансплантации.Среди многочисленных фармакологических иммуномодуляторов дексаметазон (Dex), как известно, вызывает сильную толерогенность в DCs, генерируемых из человеческих моноцитов с гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF) и интерлейкином-4 (IL-4), и эти клетки (IL -4-DCs / Dex) оцениваются как платформа на базе tDC в клинических условиях. Интерферон-α (IFNα) представляет собой еще один мощный индуктор ДК, происходящих из моноцитов, которые обладают более высокой миграционной активностью и стабильностью. Однако функции IFN-DC / Dex недостаточно проанализированы, и нет сравнительных исследований толерогенности IFN-DC / Dex и IL-4-DC / Dex.Это исследование было направлено на изучение свойств IFN-DCs / Dex по сравнению с IL-4-DCs / Dex.

    Результаты

    ДК были получены путем культивирования адгезивной фракции мононуклеарных клеток периферической крови (МНК) в присутствии GM-CSF и IFNα или IL-4 с последующим созреванием под действием липополисахаридов. Dex (10 -6 M) добавляли к культурам на 3-й день. Мы показали, что генерация IFN-DC с Dex приводила к снижению процента DC CD83 + и CD86 + и увеличению количества CD14. + , B7-h2 + и Toll-подобный рецептор 2 (TLR2 + ) DC.Лечение Dex подавляло продукцию провоспалительных цитокинов, снижало аллостимулирующую активность DC и подавляло способность DC стимулировать продукцию Th2 / провоспалительных цитокинов, что в целом свидетельствует об индукции толерогенного фенотипа. По сравнению с IL-4-DCs / Dex, IFN-DCs / Dex характеризовались большей долей клеток TLR2 + и CD14 + , более высокой продукцией IL-10 и более низким соотношением TNFα / IL-10, более мощным способность вызывать анергию Т-клеток и более эффективно смещать баланс цитокинов Т-клеток в сторону Th3 / противовоспалительного профиля.

    Выводы

    Полученные данные показывают, что сильнодействующие tDC могут быть получены путем обработки IFN-DC дексаметазоном. Толерогенные свойства IFN-DCs / Dex лучше или, по крайней мере, равны свойствам IL-4-DCs / Dex, по оценке фенотипических и функциональных анализов in vitro, что позволяет предположить, что эти клетки являются новой платформой для толерогенных вакцин.

    中文 翻译 :


    树突 状 细胞 在 干扰素 -α 的 存在 下 产生 , 并被 地 塞米松 调节 为 一种 新型 的 致 耐受 性 疫苗 平台。

    背景

    致 耐受 性 树突 状 细胞 (tDC) 被 认为 是 治疗 自身 免疫性 疾病 和 移植 反应 的 新型 治疗 工具。 众多 药理 免疫 调节 剂 中 , 地 (Dex) 可以 诱导 人 单细胞 与 粒 细胞 — 巨 噬 细胞 集 落 刺激 因子 (GM-CSF) 和 白细胞 介 素 4 (IL-4) 以及 这些 细胞 (IL) 产生 的 强 耐受 性 -4-DC / Dex) 在 临床 环境 中评估 为 tDC 的 平台。 干扰素 -α (IFNα) 代表 另 一种 强大 的 单 核 DC 诱导 剂 , 具有 更高 的 迁移。 但是 , IFN-DCs / Dex并且 没有 IFN-DCs / Dex 和 IL-4-DCs / Dex 的 致 耐受 性 的 比较

    结果

    DCs 通过 在 GM-CSF 和 IFNα 或 IL-4 存在 下 外周血 单(MNC. DC 的 产生 CD83 + 和 CD86 + DC 的 百分比 降低 , CD14 + , B7-h2 + 的 数量 增加 和 Toll 样 体 2 (TLR2 + ) DC治疗Dex了 DC 因子 的 产生 , 降低 DC 的 刺激 活性 , 并 DC Th2 / 促 炎性 细胞 因子 的 产生 了 耐受 性 IL-4-DC / Dex 相比 IFN-DCs / Dex 以下 特点 TLR2 + 和 CD14 + 大 , IL-10 产量 更高 TNFα / IL-10 更低 T反应 T 细胞 因子 平衡 偏向 Th3 / 抗炎 状态。

    结论

    的 数据 表明 通过 的 tDC。 型, IFN-DCs / Dex 的 耐受 性 优于 或 至少 IL-4-DCs / Dex 的 耐受 性 , 一种 的 耐受 性 疫苗 平台。

    Влияние вырубки косой кромки на качество онлайн-штамповки после гибки растяжением

    [1] Лу Х. Г., Ли С.Л., Исследование по проектированию и оптимизации дверной и оконной рамы автомобильной двери, Ежегодное собрание ежегодного собрания машиностроителей в Ассоциации науки и технологий провинции Аньхой, (2008), 332-334.

    [2] Чжоу К., Чжоу Х Х, Чжан С. Дж. И др., Анализ причин частичной депрессии после придания формы двери и контрмер, Die & Mold Industry, (2011).

    [3] Шенг Й Дж, Сюй Зи X, Ся Q X и др., Проектирование гибочного штампа для заготовки верхней полосы дверной рамы автомобиля, изготовление штампов и пресс-форм, 1414 (1) (2014), 29-34.

    [4] Ван Х.Дж., Тиан М.Ю., Ду Дж.З. и др., Исследование влияния структуры пуансона на лунку при штамповке без внутренней матрицы для толстостенной трубы, China Metal Forming Equipment & Manufacturing Technology, 48 (2) (2013), 84-86 .

    [5] Вэй Дж. Дж., Гонг Х Т, Пенг С. Х. и др., Анализ механизма деформации и моделирование конечных элементов при штамповке трубы без полой матрицы, Die & Mold Industry, 34 (10) (2008), 36-38.

    [6] Тан В. Дж., Пенг К. Х, Чен Х. Кью и др., Конструктивное проектирование и оптимизация штампа без штампа для пробивки отверстий в стальной трубе, Die & Mold Industry, 33 (6) (2007), 30-33.

    [7] Чжэн Х., Го-Фэн Л. И., Техника и конструкция штампа для прошивки прямоугольной трубы, Die & Mold Industry, (2006).

    [8] Ганг Л., Лин Дж Ф, Ганг В. и др., Влияние свойств трубки на качество гидропоршинга, Сделки Общества цветных металлов Китая, 21 (2011), 456-460.

    DOI: 10.1016 / s1003-6326 (11) 61624-5

    [9] Ся Q X.Процесс штамповки и конструкция штампа, Пресса Южно-Китайского технологического университета, Гуанчжоу (2004 г.).

    [10] Чен И Б, Ся Q X, Шен Й Дж и др., Численное моделирование изгиба при растяжении верхней полосы, используемой для дверной коробки автомобиля, Технология машиностроения и электротехники, 7 (2014), 47-50.

    [11] Ху Дж., DEFORM-3D пластиковый формовочный курс CAE, Peking University Press, Пекин, (2011).

    [12] Уолш М. Т., Куннейн Е. М., Малвихилл Дж. Дж. И др., Подходы к одноосному испытанию на растяжение для характеристики атеросклеротических бляшек, Журнал биомеханики, 47 (4) (2014), 793-804.

    DOI: 10.1016 / j.jbiomech.2014.01.017

    [13] Се Х, Ли Дж. М., Ван С. Э. и др., Исследование и применение износа штампа. Анализ методом CAE штамповки сверхвысокопрочной стали, Журнал естественных наук Хунаньского университета, 42 (8) (2015), 15-21.

    [14] Quan Y X и др., Engineering Tribology, Zhejiang University Press, Ханчжоу (1994).

    IJMS | Бесплатный полнотекстовый | Нарушение регуляции мембранной экспрессии TNFα в дендритных клетках пациентов с глиобластомой приводит к ухудшению цитотоксической активности против аутологичных опухолевых клеток

    1. Введение

    Дендритные клетки (ДК) играют ключевую роль в противоопухолевых иммунных ответах благодаря своей способности представлять опухолевые антигены для наивных Т-клеток, а также для индукции образования цитотоксических CD8 + Т-лимфоцитов [1,2].За последние 20 лет, помимо антигенпредставляющей функции и способности стимулировать иммунные ответы, было показано, что ДК проявляют цитотоксическую активность в том смысле, что они могут напрямую вызывать гибель опухолевых клеток посредством механизмов, опосредованных гранулами и рецепторами смерти [3, 4]. Первый механизм связан с высвобождением цитотоксических медиаторов перфорина и гранзима В из литических гранул ДК [5,6,7]. Последний путь включает экспрессию цитотоксических молекул, принадлежащих к семейству факторов некроза опухолей (TNFα, FasL, TRAIL и др.)) на поверхности ДК, которые вызывают гибель опухолевых клеток-мишеней путем связывания с соответствующими рецепторами [3,5,8,9]. Тем не менее, киллерная функция ДК плохо изучена, что вызывает множество вопросов относительно ее роли в противоопухолевых иммунных ответах. Поскольку моноциты действуют как естественный пул клеток-предшественников ДК при патологии, значительная часть ДК в микроокружении опухоли происходит из моноцитов. Обычные модели для исследований таких ДК in vitro основаны на культурах ДК, полученных из моноцитов в присутствии GM-CSF и IL-4 (IL-4-DC) [10].В то же время важную роль в генерации ДК из моноцитов играют интерфероны I типа, особенно IFNα, который продуцируется большинством клеток в ответ на воспалительные стимулы и действует как сигнал опасности [11]. IFNα способен запускать быструю дифференцировку циркулирующих моноцитов в ДК [12]. Более того, сам IFNα и IFNα-активируемые факторы транскрипции (STAT1, IRF7, ISGF3 и др.) Регулируют не только большинство генов, участвующих в дифференцировке ДК [12], но и гены, кодирующие цитотоксические молекулы (TRAIL, перфорин и гранзимы) [5].Дифференцированные в присутствии IFNα (IFN-DC) DC представляют собой уникальную популяцию DC, которая отличается от IL-4-DC более выраженной антигенпрезентирующей способностью, более высокой миграционной активностью и более стабильным фенотипом [13,14, 15,16]. Кроме того, IFN-DC проявляют цитотоксическую активность против различных линий опухолевых клеток, экспрессируют широкий спектр цитотоксических лигандов (TNFα, TRAIL, FasL, перфорин), а также секретируют гранзим B, который практически не продуцируется IL-4-DC [5 , 9]. В процессе роста опухоли функциональная активность ДК часто нарушается, что снижает эффективность противоопухолевых иммунных ответов.Наши предыдущие исследования показали, что ИФН-ДК от пациентов с глиомами высокой степени злокачественности (мультиформная глиобластома) в отличие от ДК, полученных от пациентов с глиомами низкой степени злокачественности, характеризуются нарушенной TNFα / TNF-R-зависимой цитотоксичностью. Этот дефект проявляется в сниженной способности IFN-DC лизировать клетки карциномы гортани HEp-2 (которые избирательно чувствительны к TNFα / TNF-R1-опосредованному лизису), и было показано, что этот дефект связан с характерными низкими уровнями экспрессии. мембранной формы TNFα (mTNFα), присутствующей на полученных от пациента ДК [17,18].Учитывая, что мультиформная глиобластома характеризуется крайне неблагоприятным прогнозом даже при использовании интенсивной лучевой и химиотерапии [19], можно предположить, что нарушение эффекторной функции ДК могло быть одной из причин агрессивного поведения опухоли. Однако чувствительность клеток глиобластомы к цитотоксической активности, опосредованной ДК, остается малоизученной. В целом мы полагаем, что разработка возможных методов регулирования цитотоксической активности ДК будет представлять большой клинический интерес.Действительно, усиление опосредованной ДК цитотоксичности или получение ДК с высоким цитотоксическим потенциалом может составлять новые подходы в противоопухолевой иммунотерапии.

    В настоящем исследовании мы оцениваем цитотоксическую активность IFNα-индуцированных дендритных клеток против клеточных линий глиобластомы, полученных из первичных культур опухолевых клеток, и исследовали механизмы, лежащие в основе лизиса клеток глиобластомы, опосредованного DC. Полученные данные выявили дефект TNFα / TNF-R1-зависимой цитотоксичности ДК в отношении аутологичных опухолевых клеток у пациентов с глиобластомой.Таким образом, мы также выяснили молекулярные механизмы нарушения цитотоксичности, а также проанализировали подходы к усилению эффекторных функций DC.

    2. Результаты

    2.1. Клеточные линии глиобластомы, полученные из культур первичных опухолей, и иммортализованная линия клеток U87, различаются по экспрессии рецепторов смерти семейства TNF

    Мы использовали краткосрочные клеточные линии, полученные из первичных культур клеток глиобластомы, в качестве модели для изучения цитотоксического потенциала IFN-DC. . Такой подход позволил увеличить количество опухолевых клеток после нескольких пассажей, а также получить морфологически однородные популяции клеток.Стандартная иммортализованная клеточная линия глиобластомы U87 служила контрольной культурой в различных сериях экспериментов.

    Конкретные линии клеток глиобластомы, изученные здесь, различались морфологически, но в целом проявляли черты, характерные для клеток U87 (рис. 1a). Клеточные линии глиобластомы обладали высокой пролиферативной активностью, которая оставалась на том же уровне при последующих пассажах (рис. 1b). Пролиферативная активность (относительное количество клеток Ki-67 + ) варьировала от 4,4% до 88,7% в зависимости от конкретной клеточной линии (среднее значение 40.0% ± 21,2%). Для некоторых клеточных линий этот показатель даже превышал уровень пролиферации клеточной линии U87 (> 43,0%). Ранее нами было показано, что клетки глиобластомы экспрессируют оба типа рецептора TNFα: TNF-R1 и TNF-R2 [20]. Более того, рецептор TNF-R2, в котором отсутствует домен смерти (DD) [21], экспрессировался на клетках глиобластомы в меньшей степени, чем DD-содержащий рецептор TNF-R1. Как показано на рисунке 1, клетки глиобластомы также экспрессировали другие семейства TNF. рецепторы, содержащие домен DD (рецепторы TRAIL-R и Fas).Клеточные линии глиобластомы характеризовались высокими уровнями экспрессии TRAIL-R2 (в среднем 54,8% ± 18,8%; рис. 1c). Только одна линия опухолевых клеток оказалась TRAIL-R2-отрицательной. Во всех других случаях соотношение клеток TRAIL-R2 + в изученных линиях краткосрочных клеток глиобластомы варьировало от 22,0% до 95,0% в зависимости от линии клеток. Клетки глиобластомы U87, считающиеся чувствительными к TRAIL-опосредованному лизису [22], экспрессировали TRAIL-R2 на более низком уровне, чем несколько линий неиммортализованных клеток глиобластомы.Клетки глиобластомы также характеризовались более низкой частотой экспрессии рецептора Fas (средняя частота 19,6 ± 8,1%; рис. 1d), чем клетки U87 (средняя частота 36,0 ± 4,0%).

    Таким образом, наличие проапоптогенных рецепторов на опухолевых клетках, полученных из первичной культуры глиобластомы, указывает на возможную чувствительность клеток глиобластомы к рецептор-опосредованному лизису. Кроме того, индивидуальные различия, наблюдаемые в уровнях экспрессии изучаемых здесь рецепторов в клеточных линиях глиобластомы, полученных от разных пациентов, могут определять разные уровни чувствительности опухолевых клеток к апоптозу.

    2.2. Клеточные линии глиобластомы чувствительны к цитотоксическому эффекту донорских IFN-DC через механизм индукции апоптоза
    Как показано на фиг. 2a, IFN-DC, полученные от здоровых доноров, лизировали все 13 испытанных клеточных линий глиобластомы. В зависимости от клеточной линии значения цитотоксичности IFN-DC варьировали от 20% до 85%, что отражало индивидуальные различия в чувствительности клеточных линий глиобластомы к уничтожению. В большинстве клеточных линий (9 из 13) донорские ДК обладали выраженной способностью лизировать клетки глиобластомы (цитотоксичность> 40%).Более того, цитотоксическая активность IFN-DC против многих клеточных линий глиобластомы была выше, чем наблюдаемая против иммортализованных клеток U87.

    В отличие от DC, супернатанты донорского IFN-DC (при концентрации 25%, об. / Об.) Обладали слабой цитотоксической активностью (≤12%) в отношении клеточных линий глиобластомы, и, кроме того, супернатанты IFN-DC не лизировали клетки U87 (данные не показаны ). Таким образом, для запуска цитотоксической активности IFN-DC против клеток глиобластомы требовался прямой контакт между DC и опухолевыми клетками.

    Совместное культивирование клеток глиобластомы, предварительно меченных витальным красителем CFSE и донорскими IFN-DC (рис. 2b), привело к заметному увеличению относительного количества клеток аннексина V + , в основном из-за раннего апоптоза (аннексин V + PI ).Таким образом, цитотоксический эффект донорских ДК опосредован индукцией апоптоза в клетках глиобластомы.
    2.3. Гранулы-опосредованный и TNFα / TNF-R1-зависимый лизис являются преобладающими механизмами цитотоксичности IFN-DC в отношении клеточных линий глиобластомы, полученных из первичных опухолевых культур
    Далее мы рассмотрели роль индивидуальных механизмов, опосредованных рецепторами смерти, лежащих в основе цитотоксического действия IFN. -DC. С этой целью мы провели серию экспериментов, включающих ингибирование лигандов TNFα, FasL и TRAIL путем предварительной обработки донорных IFN-DC растворимыми рецепторами rTNF-R1, rFas и rTRAIL-R2 (рис. 2c – e).Самый сильный ингибирующий эффект наблюдался при обработке IFN-DC растворимым рецептором rTNF-R1. Таким образом, ингибирование TNFα / TNF-R1-зависимого пути (фиг. 2c) снижает цитотоксическую активность донорских DC в 6 из 8 протестированных клеточных линий (среднее значение подавления 33%). Однако не наблюдалось снижения цитотоксичности ДК после обработки двух клеточных линий глиобластомы (GB # 10 и GB # 13) и клеток U87 rTNF-R1, что указывало на то, что эти клеточные линии были устойчивы к TNFα-зависимому лизису. Fas-зависимый путь (фиг. 2d) снижает цитотоксическую активность донорских DC в отношении 3 из 6 испытанных линий клеток (GB № 7, GB № 11 и GB № 12).Медиана ингибирующего действия rFas на чувствительные клетки составляла 19,6%. Ингибирующий эффект rFas на цитотоксичность ДК также наблюдался в культурах клеток U87, что согласуется с литературными данными о чувствительности этой линии клеток к FasL-зависимому апоптозу [22]. Аналогичные результаты были получены при ингибировании TRAIL-зависимого пути. . Снижение цитотоксической активности при обработке IFN-DC растворимым рецептором rTRAIL-R2 (рис. 2e) также было обнаружено только в 3 из 6 протестированных линий клеток глиобластомы (GB # 7, GB # 10 и GB # 11) (среднее подавление, 21.0%) и в клеточной линии U87, которая, как сообщается, относится к группе TRAIL-чувствительных опухолевых клеток [22]. Поскольку ингибирование сигнальных путей, опосредованных рецептором смерти, либо частично нейтрализует цитотоксический эффект донорских IFN-DC, либо действительно не влияют на эту функцию, мы изучили возможное участие механизма, опосредованного перфорином / гранзимом B, в цитотоксической активности IFN-DC против клеток глиобластомы. Для этого донорские ДК были предварительно обработаны конканамицином А (CMA), который является специфическим ингибитором вакуолярной H + -АТФазы.Известно, что CMA способствует нейтрализации pH в литических гранулах, что в конечном итоге приводит к инактивации перфорина [23,24]. Обработка ДК конканамицином А (рис. 2f) снижала цитотоксическую активность ДК против всех протестированных клеточных линий (средний ингибирующий эффект 37%), а также против клеток U87 (средний ингибирующий эффект 27,3%). Мы подтвердили участие гранулы. -опосредованный механизм цитотоксической активности IFN-DC в отношении клеточных линий глиобластомы в экспериментах по дегрануляции DC. Действительно, совместное культивирование донорских IFN-DC с клетками глиобластомы (рис. 2g) привело к более чем 3-кратному увеличению количества DC, экспрессирующих CD107a (CD107a + CFSE + клетки), которые представляют собой мембрану литических гранул. маркер.Таким образом, опосредованный гранулами и TNFα / TNF-R1-зависимый пути являются основными механизмами, лежащими в основе цитотоксической активности IFN-DC против большинства полученных краткосрочных клеточных линий глиобластомы (рис. 2h), тогда как FasL / Fas- и TRAIL / TRAIL-R2- зависимые пути не являются критическими, что вносит значительно меньший вклад в донорскую IFN-DC-опосредованную цитотоксическую активность против клеток глиобластомы.

    Важно отметить, что не наблюдалось корреляции между уровнем ингибирующего эффекта, опосредованного изученными нейтрализующими молекулами, и экспрессией соответствующих рецепторов на опухолевых клетках.Таким образом, различия в чувствительности опухолевых клеток к лизису, опосредованному рецепторами смерти, не полностью связаны с характеристиками экспрессии этих рецепторов. Более того, полученные данные показывают, что, несмотря на схожее гистогенетическое происхождение опухолевых клеток от пациентов с глиобластомой, они отличаются от иммортализованных клеток глиобластомы U87 своей чувствительностью к DC-опосредованному лизису и определенными путями, участвующими в этом процессе.

    2.4. Снижение цитотоксической активности IFN-DC от пациентов с глиобластомой в отношении аутологичных и аллогенных клеток глиобластомы, чувствительных к TNFα / TNF-R1-опосредованному лизису
    IFN-DC, генерируемые из моноцитов пациентов с глиобластомой, характеризовались фенотипическими профилями с задержкой клеточной дифференцировки, но выраженными равными уровнями молекулы, участвующие в презентации антигена (HLA-DR, CD86) донорским IFN-DC, как показано в таблице 1, которая подтверждает наши предыдущие результаты [25].По сравнению с донорскими ИФН-ДК, ИФН-ДК от пациентов с глиобластомой показали на 30% меньшую цитотоксическую активность по отношению к тем же клеточным линиям глиобластомы (p = 0,05; рис. 3а). В этих экспериментах мы тестировали ДК, взятые от 4-15 человек, против каждой клеточной линии. . Дефектная цитотоксическая активность IFN-DC, полученных от пациентов с глиобластомой, против аутологичных опухолевых клеток наблюдалась только в клеточных линиях, чувствительных к TNFα / TNF-R1-опосредованному лизису (таблица 2). Однако, если клетки не были чувствительны к TNFα / TNF-R1-зависимому сигнальному пути (GB # 10, GB # 13), цитотоксическая активность IFN-DC, полученных от пациентов, была сравнима с таковой донорского происхождения.Сходные результаты были получены для цитотоксической активности аллогенных IFN-DC от пациентов с глиобластомой в отношении исследованных линий опухолевых клеток (рис. 3b). Только когда клетки глиобластомы были устойчивы к TNFα-опосредованному лизису (GB # 10), цитотоксическая активность была одинаковой для ДК здорового донора и полученного от пациента. Во всех других случаях цитотоксичность ДК, полученных от пациентов, в отношении линий аллогенных клеток глиобластомы была ниже, чем в отношении тех же опухолевых клеток.

    Мы не обнаружили корреляций между чувствительностью клеточной линии к другим TNFα / TNF-R1-независимым механизмам и дефектной цитотоксичностью ДК пациентов.

    Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что TNFα / TNF-R1-зависимый механизм играет важную роль в опосредованной DC цитотоксичности в отношении аутологичных опухолевых клеток и что дефектная TNFα-опосредованная цитотоксичность DC ответственна за снижение эффекторных функций IFN-DC пациентов.

    2,5. IFN-DC от пациентов с глиобластомой не отличаются от донорных IFN-DC по структуре молекулярной экспрессии внутриклеточных цитолитических гранул и поверхностных лигандов FasL и TRAIL
    . Ранее мы показали, что IFN-DC от пациентов с глиобластомой характеризуются пониженной экспрессией mTNFα по сравнению с донорским IFN-DC [18].Здесь мы показываем, что экспрессия других молекул, участвующих в цитотоксической активности DC, у пациентов с глиобластомой сохраняется. Таким образом, IFN-DC от пациентов с глиобластомой были сопоставимы с донорскими IFN-DC с точки зрения экспрессии определенных внутриклеточных молекул в цитолитических гранулах, таких как перфорин, гранзим B, CD107a (рисунок 3d), а также поверхностные молекулы FasL и TRAIL (рисунок 3c ).

    Следовательно, сниженная экспрессия mTNFα на IFN-DC у пациентов с глиобластомой может быть ключевым фактором, ответственным за нарушение цитотоксической функции DC против опухолевых клеток, чувствительных к TNFα / TNF-R1-зависимому лизису.В то же время сохраненная экспрессия других лигандов, в основном перфорина и гранзима В, позволяет ДК от пациентов с глиобластомой лизировать опухолевые клетки, хотя и на более низком уровне по сравнению с донорскими ИФН-ДК.

    2.6. Снижение цитотоксичности IFN-DC у пациентов с глиобластомой связано с низким уровнем мРНК TNFα и высокой активностью TACE / ADAM-17
    Затем мы изучили возможные причины нарушения экспрессии mTNFα, в конечном итоге приводящие к селективному нарушению TNFα-опосредованной цитотоксической функции IFN- ДК от пациентов с глиомами высокой степени злокачественности против аутологичных опухолевых клеток.IFN-DC от пациентов с глиобластомой характеризовались более чем двукратным снижением уровней мРНК TNFα по сравнению с донорскими IFN-DC (Me 2 — ΔΔCt = 0,35; p = 0,05; рисунок 4a). Экспрессия mTNFα также зависит от интенсивности выделения и активности TNFα-превращающего фермента (TACE / ADAM-17), который расщепляет внеклеточную часть mTNFα и превращает ее в биологически активную секретируемую форму TNFα (sTNFα) [26]. Прежде чем сравнивать экспрессию TACE / ADAM-17 в DC от здоровых доноров и пациентов, мы определили оптимальные контрольные точки обнаружения ферментов в ответ на стимуляцию LPS (рис. 4b).Резкое снижение уровней ТАСЕ / ADAM-17 наблюдалось в течение первых 60 минут после добавления ЛПС к донорским культурам IFN-DC. Впоследствии уровни экспрессии TACE / ADAM-17 увеличивались, достигая максимума через 2 часа после начала стимуляции, а затем оставались обнаруживаемыми до 24 часов культивирования с последующим постепенным снижением. На основании полученных данных мы провели сравнительный анализ экспрессии TACE / ADAM-17 на IFN-DC от здоровых доноров и пациентов с глиобластомой через 2 ч после лечения LPS. На рисунке 4в показано, что интактные (не стимулированные ЛПС) ДК от пациентов характеризовались более выраженной экспрессией фермента TACE / ADAM-17, чем донорские ДК (p = 0.17). Более того, уровни экспрессии TACE / ADAM-17 в LPS-стимулированных культурах DC, полученных от пациентов, были более чем в два раза выше, чем у здоровых донорских DC (p = 0,035). Максимальная активность TACE / ADAM-17 в донорских IFN-DC наблюдалась в ответ на стимуляцию LPS соответствовал наивысшему уровню экспрессии этого фермента, обнаруженному через 2 ч после обработки (данные не показаны). Подобно повышенной экспрессии TACE / ADAM-17, полученные от пациентов ДК также характеризовались более высокой активностью TACE / ADAM-17 ранее (p = 0.2) и после (p = 0,08) стимуляции LPS, чем донорские DC (рис. 4d). LPS-стимулированные IFN-DC от пациентов с глиобластомой характеризовались почти в три раза большей активностью TACE / ADAM-17, чем IFN-DC донорского происхождения.

    Полученные результаты показывают, что низкие уровни экспрессии mTNFα, наблюдаемые на ДК, полученных от пациентов с глиобластомой, могут быть связаны не только с нарушением экспрессии TNFα, но также могут быть вызваны высокими уровнями экспрессии и активности TACE / ADAM-17, ответственных за выделение mTNFα из мембрана постоянного тока.

    2.7. rIL-2 и дцДНК повышают цитотоксическую активность IFN-DC в отношении аутологичных клеток глиобластомы с помощью различных механизмов
    Ранее нами было показано, что рекомбинантный интерлейкин 2 (rIL-2) и двухцепочечная ДНК человека (дцДНК) усиливают экспрессию mTNFα на IFN. -ДК от пациентов с глиобластомой [18]. Наши наблюдения могут быть важны для разработки возможных методов коррекции нарушения цитотоксической активности ДК, полученной от пациентов с глиобластомой, против аутологичных опухолевых клеток, чувствительных к TNFα / TNF-R1-зависимому лизису.Таким образом, здесь мы исследовали эффекты rIL-2 и дцДНК в качестве стимуляторов цитотоксической активности полученных от пациента ДК против клеток глиобластомы. Стимулирующий эффект rIL-2 и дцДНК на экспрессию mTNFα был связан в среднем с 1,5-кратным увеличением цитотоксической активности полученных от пациентов IFN-DC в отношении аутологичных опухолевых клеток (рис. 5). Затем мы изучили влияние rIL. -2 и дцДНК на двух потенциальных уровнях нарушенной регуляции (транскрипционной или посттрансляционной) экспрессии mTNFα в полученных от пациента DCs (Рисунок 6a – c).Интактные и обработанные rIL-2 IFN-DC характеризовались одинаково низким уровнем экспрессии мРНК TNFα (фиг. 6a). В отличие от rIL-2, обработка культур IFN-DC дцДНК увеличивала экспрессию мРНК TNFα в DC (p = 0,05). Кроме того, дцДНК снижала экспрессию TACE / ADAM-17 в IFN-DC, полученных от пациентов, и снижала его протеолитическую активность более чем на 20% (рис. 6b, c). Мы наблюдали, что rIL-2 не влияет на экспрессию TACE / ADAM-17 в IFN-DC, в целом предполагая, что rIL-2 и дцДНК регулируют экспрессию mTNFα посредством различных механизмов.Мы также оценили потенциальный эффект rIL-2 и дцДНК на экспрессию других цитотоксических лигандов, участвующих в цитотоксической активности DC против клеток глиобластомы. Активация IFN-DC, полученных от пациентов с глиобластомой с rIL-2 и dsDNA, увеличивала экспрессию медиаторов рецептор-зависимой цитотоксичности семейства TNF (FasL и TRAIL), а также гранулярно-зависимую цитотоксичность (фиг.6d). Интересно, что обработка rIL-2 вызывала статистически значимое увеличение экспрессии перфорина и дцДНК — как перфорина, так и гранзима B.

    3. Обсуждение

    В этом исследовании мы впервые показали, что IFNα-индуцированные ДК, полученные из моноцитов, могут действовать как эффекторные клетки и лизировать клетки глиобластомы, полученные из первичных опухолевых культур. Есть данные, позволяющие предположить, что клетки глиобластомы обладают низкой чувствительностью к NK-опосредованному лизису. Действительно, клетки глиобластомы экспрессируют лиганды ингибирующих рецепторов NK-клеток на своей поверхности, в то время как лиганды активирующих рецепторы NK-клеток экспрессируются на низких уровнях [27,28,29]. В этом исследовании линии клеток, полученные из первичных культур глиобластомы, проявляли различную чувствительность к цитотоксическому эффекту IFN-DC, что в целом отражает индивидуальную гетерогенность глиобластомы.Однако в большинстве случаев донорские ИФН-ДК показали достаточно высокий уровень цитотоксичности (> 40%) в отношении клеток глиобластомы. Согласно нашим наблюдениям за паттернами экспрессии рецепторов ФНО, содержащих домен смерти, на клеточных линиях глиобластомы цитотоксический эффект ИФН -ДК по отношению к клеточным линиям глиобластомы, полученным из первичных культур, могут опосредоваться через внешние рецептор-зависимые механизмы апоптоза. Данные об экспрессии рецепторов TNF-R, TRAIL-R1 / 2 и Fas на постоянных клеточных линиях глиобластомы человека (SF-126, SF-188, U-138MG, LN235 и др.)) и свежевыделенных клетках глиобластомы сообщалось ранее [30,31,32]. Однако наши результаты отличаются от результатов этих исследований, которые продемонстрировали прямую корреляцию между чувствительностью клеток глиобластомы к рецептор-опосредованным механизмам апоптоза и экспрессией соответствующих рецепторов [32,33]. В отличие от этих наблюдений, мы не обнаружили корреляции между экспрессией рецепторов TNFα, FasL и TRAIL на опухолевых клетках и ингибирующим действием растворимых рецепторов для этих лигандов.Следовательно, рецепторы TNF-R, Fas и TRAIL-R могут не только участвовать в индукции апоптоза, но и опосредовать другие эффекты, даже выступая в качестве факторов роста для клеток глиобластомы [34].

    Кроме того, мы проанализировали медиаторы цитотоксической активности DC, экспрессируемые на клеточной поверхности IFN-DC. Таким образом, ингибирование цитотоксических лигандов / медиаторов показало, что в основе цитотоксической активности донорских IFN-DC против большинства клеток глиобластомы лежат два основных пути, то есть гранулярно-зависимый и TNFα / TNF-R1-зависимый пути.

    Цитотоксичность, опосредованная гранулами, может играть важную роль в противоопухолевом иммунитете при опухолях глиомы головного мозга благодаря тому факту, что линии клеток глиомы могут быть устойчивыми к апоптозу, опосредованному рецептором смерти [35,36]. В настоящем исследовании было сделано важное наблюдение. в том, что среди изученных путей, опосредованных рецепторами, именно TNFα / TNF-R1-зависимый механизм участвовал в подавляющем большинстве случаев в лизисе клеток глиобластомы дендритными клетками. Следовательно, этот механизм вносит значительный вклад в цитотоксический потенциал IFN-DC.IFN-DC от пациентов с глиобластомой характеризовались пониженной цитотоксической активностью в отношении аутологичных опухолевых клеток. Интересно, что уровень снижения в большинстве случаев соответствовал интенсивности ингибирующего эффекта, опосредованного rTNF-R1, то есть составлял долю от общего цитотоксического потенциала, опосредованного TNFα / TNF-R1-зависимым механизмом. Мы предполагаем, что низкие уровни экспрессии mTNFα на IFN-DC, полученные от пациентов с глиобластомой, о которых сообщалось в нашем предыдущем исследовании [18], могут быть предполагаемым ключевым фактором, способствующим нарушению цитотоксической активности DC против аутологичных опухолевых клеток.

    Однако мы наблюдали отсутствие подавления общей цитотоксической активности в отношении аутологичных опухолевых клеток из-за нарушенной экспрессии mTNFα, о чем свидетельствует экспрессия других медиаторов (перфорин, гранзим B, FasL и TRAIL) в культурах IFN-DC, полученных от пациентов с глиобластомой. сохраняется на уровнях, сопоставимых с донорскими IFN-DC. Между тем, мы не можем исключить участие других рецепторно-независимых механизмов цитотоксичности ДК.

    Важный вывод из этого исследования можно сделать в отношении иммортализованной клеточной линии U87, которая отличается от большинства неиммортализованных клеточных линий глиобластомы с точки зрения своей чувствительности к IFN-DC-опосредованному цитотоксическому эффекту и задействованным механизмам лизиса.В частности, эта клеточная линия устойчива к цитотоксичности DC, опосредованной TNFα / TNF-R1. Ранее мы показали, что IFN-DC, полученные от пациентов с глиомами высокой степени злокачественности, сопоставимы со здоровыми донорскими IFN-DC с точки зрения цитотоксической активности против клеток U87 [17]. Эти результаты предполагают, что клетки U87 не являются адекватным аналогом клеток глиобластомы в качестве модели in vitro и, следовательно, не могут использоваться в качестве оптимальной модели для изучения иммунных механизмов противоопухолевой защиты, а также для разработки новых противоопухолевых препаратов.По нашим данным, снижение цитотоксической активности ДК, полученных от пациентов с глиобластомой, было связано с низким уровнем мРНК TNFα. По данным S. Hira et al., ДК, полученные от пациентов с миелоидным лейкозом, также характеризовались низкой цитотоксической активностью против TNFα-чувствительных опухолевых мишеней из-за низкой экспрессии гена TNFα в ДК [4]. Таким образом, наши результаты являются дополнительным подтверждением нарушения цитотоксической активности ДК, опосредованной TNFα, у пациентов со злокачественными опухолями. В этом исследовании мы проанализировали регуляцию экспрессии mTNFα как на транскрипционном, так и на посттрансляционном уровнях, чтобы продемонстрировать впервые высокую экспрессию. и активность TACE / ADAM-17 в IFN-DC пациентов с глиобластомой.Подобные изменения в активности TACE / ADAM-17 были также обнаружены в клетках глиомы высокой степени злокачественности, что связано с прогрессированием опухоли и плохим прогнозом [37]. Наши данные показывают, что активность TACE / ADAM-17 у пациентов с глиомами высокой степени злокачественности изменяется не только в опухолевых, но и в иммунных клетках. Это системное нарушение активности фермента может быть вызвано опухолевыми клетками и секретируемыми из них растворимыми медиаторами, влияющими на функциональную активность DC и / или их предшественников моноцитов. В этом случае высокая активность TACE / ADAM-17 в DC также может способствовать росту опухоли за счет ингибирования цитотоксической активности DC посредством снижения уровней mTNFα.Однако ингибирование TACE / ADAM-17 снижает шеддинг mTNFα на мембранах IFN-DC и усиливает цитотоксическую активность DC против TNFα / TNF-R1-чувствительных опухолевых клеток [18]. Повышенные уровни mTNFα [18] наряду с повышенной цитотоксической активностью IFN -ДК от пациентов с глиобластомой против аутологичных опухолевых клеток после лечения rIL-2 и дцДНК позиционируют эти медиаторы как активаторы цитотоксического действия, опосредованного mTNFα. Несмотря на сходный нижестоящий стимулирующий эффект, rIL-2 и дцДНК имеют разные механизмы действия на экспрессию mTNFα с помощью DC.Стимулирующее действие дцДНК на ДК связано с повышением относительно низких уровней мРНК TNFα по сравнению с исходным уровнем, а также со снижением по сравнению с исходным уровнем высоких уровней и активности фермента TACE / ADAM-17. Напротив, действие rIL-2 не связано со значительным увеличением уровня мРНК TNFα и сопутствующим подавлением активности TACE / ADAM-17, что указывает на участие других механизмов, регулирующих уровни mTNFα. Известно, что IL-2 оказывает плейотропное действие на иммунные клетки, которое опосредуется через специфический клеточный рецептор IL-2R [38].Ранее мы продемонстрировали, что IFN-DC экспрессируют высокоаффинный рецептор IL-2, CD25 [25]. Эти данные свидетельствуют о том, что IFN-DC могут быть чувствительны к модулирующему эффекту IL-2. Известно, что синтез TNFα регулируется различными протеинкиназами (протеинкиназа C, p38 MAP-киназа), которые обеспечивают стабильность мРНК TNFα [39,40]. Примечательно, что IL-2 является положительным регулятором этих киназ в активированных клетках иммунной системы [41,42,43]. Следовательно, можно предположить, что влияние rIL-2 на экспрессию TNFα в IFN-DC от пациентов с глиобластомой реализуется на посттранскрипционном уровне через протеинкиназозависимый механизм.Механизм действия дцДНК на ДК остается неясным. Было показано, что при попадании в цитозоль IFN-DC экзогенная дцДНК практически сразу же транспортируется в ядро ​​[44]. Накопление дцДНК в ядрах в IFN-DC, вероятно, обеспечивает прямую активацию экспрессии различных генов, включая TNFα, в то время как влияние на TACE / ADAM-17 может быть косвенным через регулирование направленности других молекул.

    Мы продемонстрировали, что введение rIL-2 и дцДНК значительно увеличивало экспрессию перфорина и гранзима B (обработка дцДНК), а также имело тенденцию к усилению экспрессии FasL и TRAIL на полученных от пациентов IFN-DC.Эти данные позволяют предположить, что rIL-2 и дцДНК могут рассматриваться как активаторы TNFα-независимой цитотоксической активности полученных от пациента IFN-DC против аутологичных клеток глиобластомы.

    Что касается ограничений исследования, мы использовали не первичные опухолевые клетки, а клеточные линии, полученные из первичных культур глиобластомы, в качестве клеток-мишеней для изучения чувствительности глиобластомы к DC-опосредованной цитотоксической активности. Хотя специфические свойства самой опухоли и присущие им клеточные взаимоотношения сохраняются в культурах первичных опухолевых клеток, скорость клеточной пролиферации в таких культурах снижается, что ограничивает возможность проведения некоторых исследований.Получение клеточных линий из первичных культур позволило увеличить количество опухолевых клеток после нескольких пассажей и получить морфологически однородные клеточные популяции. Кроме того, глиобластома характеризуется низкой мутационной нагрузкой и низкой способностью к образованию неоантигенов [45], и эти свойства могут сохраняться в клеточных линиях, полученных из первичных культур клеток глиобластомы [46]. В совокупности мы заключаем, что способность ДК к лизировать опухолевые клетки — важное явление. Полученные данные характеризуют прямое цитотоксическое действие IFN-DC на клетки глиобластомы и демонстрируют избирательный (TNFα / TNF-R1-опосредованный) дефект этой функции у DC, полученных от пациентов с глиобластомой.Мы определили механизм, лежащий в основе снижения цитотоксического потенциала ДК у пациентов с глиобластомой, и определили цели дальнейших исследований, направленных на регуляцию цитотоксических функций и возможность коррекции цитотоксических свойств ДК у онкологических больных. Генерация ДК, которые не только вызывают иммунные ответы, но и обладают высоким цитотоксическим потенциалом против опухолевых клеток, потенциально может изменить наши клинические подходы к лечению и пути введения вакцин на основе ДК, а также сделать возможным достижение более положительных клинических результатов. иммунотерапии.Это исследование подчеркивает актуальность фундаментальных исследований с точки зрения улучшения нашего диагностического и лечебного потенциала (таких как определение подходящих биомаркеров и попытки сформулировать новые фармакологические стратегии [47]) для пациентов с глиомами высокой степени злокачественности, которым предстоит сложное хирургическое лечение. и бесконечный курс адъювантной терапии. Цитотоксическая активность ДК существенно облегчает захват опухолевого антигена и его последующую презентацию Т-клеткам и может использоваться в качестве терапевтического инструмента для усиления иммунного ответа, направленного на устранение опухолевых клеток.

    4. Материалы и методы

    4.1. Пациенты

    В исследование были включены 43 пациента с мультиформной глиобластомой (25 мужчин и 18 женщин в возрасте от 23 до 75 лет, медиана 54 года; 27 пациентов с впервые диагностированной глиомой и 16 пациентов с рецидивной глиомой), лечившихся в отделении нейрохирургии Новосибирска, Институт травматологии и ортопедии в 2016–2019 гг. Гистологический анализ опухолевых тканей головного мозга проводили согласно классификации опухолей центральной нервной системы Всемирной организации здравоохранения 2016 г.Девяносто семь здоровых анонимных лиц того же возраста и пола были набраны в качестве здорового контроля. Информированное согласие было получено от всех пациентов и доноров в соответствии с Хельсинкской декларацией. Исследование одобрено локальными этическими комитетами Института фундаментальной и клинической иммунологии (протокол № 28 от 15 декабря 2015 г.) и Института травматологии и ортопедии (протокол № 1 от 11 января 2016 г.).

    4.2. Генерация DC
    Для генерации DC прикрепляющиеся к пластику мононуклеарные клетки (преимущественно моноциты), выделенные из периферической крови центрифугированием в градиенте плотности с использованием Ficoll-Paque (GE Healthcare, Фрайбург, Германия), культивировали в среде RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, Irvine, UK), дополненный 0.3 мг / мл L-глутамина, 5 мМ буфера HEPES, 100 мкг / мл гентамицина и 2,5% эмбриональной сыворотки теленка (FCS, Sigma-Aldrich) в присутствии rhGM-CSF (40 нг / мл, Sigma-Aldrich) и rhIFN -α (Roferon-A, 1000 Ед / мл, Roche, Швейцария) при 37 ° C и концентрации CO 5% 2 в течение 4 дней. Созревание DC индуцировали дальнейшим воздействием стандартной концентрации липополисахаридов [48] (10 мкг / мл, LPS, E. coli O114: B4, Sigma-Aldrich, Иерусалим, Израиль) в течение дополнительных 24 часов. Жизнеспособность ДК, определенная по исключению трипанового синего, во всех случаях составляла более 93–95%.Фенотипические характеристики IFN-DC, полученных от донора и пациента, показаны в таблице 1. В некоторых сериях экспериментов рекомбинантный человеческий интерлейкин-2 (rIL-2, 50 Ед / мл) и двухцепочечная ДНК человека (dsDNA) (5 мкг / мл) добавляли одновременно с LPS к культурам клеток DC пациентов. Двухцепочечную ДНК получали, как описано в предыдущих сообщениях [49]. Вкратце, ДНК человека выделяли из плаценты здоровых женщин безфенольным методом. ДНК фрагментировали в ультразвуковом дезинтеграторе с частотой 22 кГц для получения смеси фрагментов ДНК размером от 200 до 6000 п.н.Препараты ДНК растворяли в физиологическом растворе и хранили при -20 ° C.
    4.3. Линии опухолевых клеток

    Первичные культуры клеток глиобластомы были получены путем механического и ферментативного (0,3% коллагеназа, Sigma-Aldrich, Реховот, Израиль) дезагрегации опухолевых проблем, полученных от пациентов с гистологически подтвержденной мультиформной глиобластомой (степень IV, n = 13). Суспензии клеток культивировали в среде DMEM / F12 (Gibco, Пейсли, Великобритания) с добавлением 0,3 мг / мл L-глутамина, 5 мМ буфера HEPES, 10 -4 М меркаптоэтанола, 100 мкг / мл гентамицина и 10% FBS.Клетки обновляли новой культуральной средой дважды в неделю и поддерживали при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO 2 . Первичные культуры клеток пассировали по достижении клеточного субконфлюэнта (70–80%) с использованием 0,25% трипсина / ЭДТА (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Клетки далее культивировали в виде клеточных линий (n = 13) в полной культуральной среде. Число пассажей для клеточных линий, полученных из первичных культур опухолевых клеток, составляло от двух до пяти.

    Клеточная линия иммортализованной глиобластомы человека U-87 была получена от Dr.Шилова (Федеральный исследовательский центр Института цитологии и генетики СО РАН) и культивировали в среде αMEM (Gibco, Пейсли, Великобритания) с добавлением 100 мкг / мл гентамицина и 10% FBS.

    4.4. Анализ проточной цитометрии

    Фенотип ДК анализировали проточной цитометрией на основе экспрессии поверхностных молекул с использованием конъюгированных с флуорохромом mAb (BD Pharmingen ™, Сан-Хосе, Калифорния, США; R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США), специфичных для CD14 (FITC) , CD83 (Pe), CD86 (FITC), HLA-DR (FITC), CCR7 (Pe), FasL (Pe), TRAIL (Pe), CD107a (APC) или TACE / ADAM-17 (APC).Для обнаружения внутриклеточных молекул IFN-DC были пермеабилизированы с использованием набора растворов для фиксации / пермеабилизации (BD Cytofix / Cytoperm ™, Сан-Хосе, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя и окрашены анти-CD107a- (APC, BD Pharmingen ™). , США), mAb против гранзима B- (Pe, BD Pharmingen ™, США), против перфорина (Pe, BioLegend, San Diego, CA, USA). В каждый эксперимент включали соответствующие изотипу контрольные моноклональные антитела для определения неспецифического фонового окрашивания. Клетки анализировали проточной цитометрией с использованием проточного цитометра BD FACSCalibur (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США) и программы анализа CellQuest.Из каждой пробы клеток было собрано не менее 10 000 событий.

    Фенотипирование опухолевых клеток выполняли путем окрашивания mAb против Fas (FITC) и против TRAIL-R2 (Pe) (BD Pharmingen ™, США) в соответствии со стандартной процедурой после пассажа с 0,25% трипсином / EDTA. Для оценки пролиферативной активности опухолевых клеток использовали Pe-конъюгированные mAb против Ki-67 (BD PharMingen, San Jose, CA, USA) и соответствующие контрольные mAb изотипа в сочетании с окрашиванием внутриклеточных молекул.

    4.5. Анализ МТТ

    клеточных линий глиобластомы, полученных из первичных опухолевых культур, и клеточной линии U87 (50 × 10 3 клеток / лунка) культивировали с LPS-стимулированными донорскими IFN-DC в 96-луночных планшетах с плоским дном в соотношении 1: 1 в трех экземплярах. В некоторых экспериментах ДК предварительно инкубировали в течение 1 ч с рекомбинантным химерным белком TNFR1 / TNFRSF1A Fc человека (10 мкг / мл, R&D Systems, США), рекомбинантным химерным белком rhFas / TNFRSF6 / CD95 Fc человека (10 мкг / мл. , R&D Systems, США), рекомбинантный химерный белок Fc rhTRAIL R2 / TNFRSF10B человека (10 мкг / мл, R&D Systems, США) или в течение 2 ч с конканамицином A (100 нМ, Sigma-Aldrich, Милан, Италия) .

    После 20 ч инкубации раствор MTT (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) 2,5-дифенилтетразолий бромид, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) (20 мкл 5 мг / мл сток) добавляли в каждую лунку, и планшеты инкубировали в темноте в течение 4 ч при 37 ° C. Затем планшеты центрифугировали при 1500 об / мин в течение 5 минут, среду удаляли и в каждую лунку добавляли диметилсульфоксид (150 мкл, ДМСО, MP Biomedicals, LLC, Illkirch Cedex, Франция) для растворения кристаллов формазана. Поглощение при 492 нм измеряли с помощью многолуночного спектрофотометра (Thermo Scientific Multiskan FC, Вантаа, Финляндия).Процент цитотоксичности (%) рассчитывали по следующей формуле: [1- (поглощение в экспериментальной лунке с целевыми и эффекторными клетками — фоновое поглощение эффекторных клеток / поглощение необработанных клеток-мишеней)] × 100.

    4.6. Анализ апоптоза

    Клетки глиобластомы, окрашенные флуоресцентным красителем N-сукцинимидилового эфира (CFSE) диацетата 5 (6) -карбоксифлуоресцеина (CFSE) (2 мкМ; Molecular probes, Inc., Юджин, Орегон, США), инкубировали с IFN-DC в соотношении DC : опухолевые клетки 10: 1 в течение 18 ч.Процент апоптоза опухолевых клеток измеряли с использованием набора для обнаружения апоптоза аннексина V-APC (BD Pharmingen ™, США). Вкратце, клетки промывали PBS и метили APC-конъюгированным аннексином V и иодидом пропидия (PI) в течение 15 мин при комнатной температуре с последующим анализом на проточном цитометре FACSCalibur. Для каждого образца было собрано не менее 10 000 событий в пределах CFSE-положительной области ворот.

    4.7. Анализ дегрануляции CD107a

    IFN-DC инкубировали с клетками глиобластомы, предварительно окрашенными красителем CFSE, при соотношении DC: опухолевые клетки 10: 1 в течение 18 часов в присутствии APC-конъюгированных антител против CD107a человека и монензина A (10 мкМ ) (все BD Pharmingen ™).После совместного культивирования с клетками глиобластомы-мишени DC промывали и анализировали на проточном цитометре FACS Calibur с использованием программы анализа CellQuest. Частоту дегранулирующих DC измеряли как CD107a + DC, стробированные внутри CFSE-отрицательных клеток. Для каждой выборки было собрано не менее 10 000 событий в области ворот.

    4.8. Анализ экспрессии мРНК TNFa

    Препарат тотальной РНК выделяли из образцов IFN-DC здоровых доноров и пациентов до и через 2 ч после стимуляции LPS с использованием коммерческого набора RIBO-sol-B (ФГНИИ ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с инструкциями производителя.Количественное определение РНК проводили на спектрофотометре Nanodrop ND-100 (NanoDrop Technologies, Inc., США). Реакцию обратной транскрипции проводили на матрице мРНК с использованием термоциклера C1000 ™ (Bio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, Калифорния, США) и набора MMLV RT (Евроген, Москва, Россия) в соответствии с протоколом производителя. Праймеры были отобраны с помощью программы Vector NTI и синтезированы компанией Biosset. Последовательности праймеров, используемых в количественной ПЦР в реальном времени (для прямого праймера, rev, обратного праймера):

    • TNFα-для 5′-CCAATGGCGTGGAGCTGAGA-3 ‘

    • TNFα-rev 5′-TGATGGTGTGGGTGAGGAGCAC-3′

    • AGATGATP0-

      AGATP00003

      AGATP00003

      AGATP00003 ′ -TATCCTCGTCCGACTCCTCCGA-3 ′.

    ПЦР в реальном времени выполняли в 96-луночных планшетах с использованием реагентов SYBR® Green PCR Master Mix на приборе ViiATM (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Условия реакции включали начальную денатурацию (95 ° C) и последующие 40 циклов репликации (95 ° C 15 с, 58 ° C 30 с и 72 ° C 60 с). Каждый продукт ПЦР включал триплеты тестируемых образцов. Результаты количественной ПЦР в реальном времени анализировали с помощью программного обеспечения QuantStudioTM Real-Time PCR Software v1.1. Уровень мРНК гена TNFα был нормализован по большой субъединице P0 кислого фосфорилированного белка рибосомы (RPLP0) с помощью метода 2 −∆∆Ct .В качестве контрольной группы использовали IFN-DC здоровых доноров, а уровень экспрессии гена TNFα был принят равным 1.

    4.9. Анализ активности TNFα-превращающего фермента (TACE / ADAM-17)

    Для оценки активности фермента TACE / ADAM-17 в DC в ответ на стимул (LPS, rIL-2, dsDNA) коммерческий набор для анализа активности TACE SensoLyte®520 ( Anaspec, Inc, Фремонт, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя. Активность фермента измеряли по интенсивности флуоресценции, определяемой спектрофлуориметрическим методом.Параллельно с этим методом Брэдфорда определяли концентрацию белка в образцах DC. Результаты выражали в относительных флуоресцентных единицах на 1 мкг белка в данном образце (RFU / мкг белка).

    4.10. Статистический анализ

    Статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения Statistica 6.0 и GraphPad Prism 8.0. Данные представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего (SE), а также медианы (Me) и межквартильного размаха (LQ – UQ, 25–75% квартиль) для каждой группы. Статистические различия анализировали с помощью U-критерия Манна – Уитни или парного критерия знаков.Корреляции между переменными оценивались с помощью критерия ранговой корреляции Спирмена. Значение p <0,05 считалось статистически значимым. Анализ тепловой карты проводился с использованием программы GraphPad Prism 8.0.

    Клиническое испытание воспалительной миофибробластной опухоли: кризотиниб — Реестр клинических испытаний

    Краткое изложение

    Таргетная терапия, основанная на идентификации мишени с помощью генетических исследований, — перспективное направление лечения пациентов с осложненным течением воспалительной миофибробластической опухоли.В последнее время основная работа, освещаемая в зарубежных публикациях, направлена ​​на поиск дополнительных методов лечения путем определения новых целей для таргетной терапии у пациентов с неоперабельной ТИМ, но в настоящее время во всем мире не существует стандартизированного подхода к лечению ТИМ у детей. Это исследование может показать преимущества использования кризотиниба в качестве таргетной терапии у детей с ALK / ROS1-положительными неоперабельными, прогрессирующими или рецидивирующими воспалительными миофибробластными опухолями. Основная гипотеза заключается в том, что кризотиниб повысит частоту объективного ответа в этой группе пациентов.

    Подробное описание

    Воспалительная миофибробластическая опухоль (IMT) — это редкий тип детского новообразования, характеризующийся промежуточным биологическим поведением. Основной метод лечения этой опухоли — полное хирургическое удаление. Следует сказать, что у 2-5% пациентов на момент постановки диагноза отмечалось наличие отдаленных метастазов, кроме того, сложная анатомическая локализация процесса иногда не позволяет провести радикальное хирургическое вмешательство.У пациентов с неоперабельной ТИМ, наличием отдаленных метастазов, остаточной опухоли после первоначальной резекции или прогрессирования заболевания делались попытки назначить терапию стероидами, нестероидными противовоспалительными препаратами (НПВП), цитостатическими препаратами. Однако эффективность этой терапии была низкой. С конца 90-х годов известно, что при выявлении ряда специфических цитогенетических изменений этот вид новообразования представляет собой истинный неопластический процесс. В 50% всех случаев IMT имеют место клональные транслокации гена ALK, расположенного в 2p23, кодирующем киназу анапластической лимфомы (ALK).Было показано, что активация гена ALK основана на транслокациях с участием большого количества генов-партнеров с тирозинкиназной активностью. В настоящее время в образовании химерных транскриптов участвует более 21 гена-партнера. Наиболее частыми являются TPM3, TPM4, CLTC, CARS, RANBP, EML4, TFG. Внедрение современных молекулярно-генетических методов, включая секвенирование следующего поколения (NGS), расширило понимание механизмов канцерогенеза в IMT. Наряду с перестройками гена ALK в группе пациентов с ALK-негативным IMT были обнаружены гены ROS1 (YWHAE-ROS1 и TFG-ROS1) и PDGFRB (NAB2).Терапия ингибиторами тирозинкиназы (кризотиниб) стала возможной не только у пациентов с ALK-положительной опухолью, но и в группе пациентов, у которых нет реаранжировки гена ALK, но у которых была обнаружена реаранжировка гена ROS1. [4]. Ранее крупномасштабные исследования с использованием ингибиторов тирозинкиназы (кризотиниба) у пациентов младше 18 лет с ТИМ не проводились. Исследование фазы 1, проведенное Детской онкологической группой (США), показало частоту ответа на терапию кризотинибом у 3/7 пациентов, а.стабилизация заболевания у 4/7 пациентов (Mosse Y., 2013). Средний возраст пациентов с ТИМ, включенных в исследование, составил 8,4 года (диапазон 1,1–21,4). В данном исследовании было отмечено, что применение кризотиниба в режиме дозирования 280 мг / м2 2 раза в сутки у этой группы пациентов не приводит к увеличению частоты возникновения побочных эффектов 3 и 4 степени. Определена максимально допустимая доза, которая составила 560 мг / м2 / сут в два приема. В исследовании фазы 2 было показано, что в группе пациентов с ИМО ответ был достигнут в 86% случаев, при этом полный ответ был достигнут в 36% (5/14), частичный ответ — в 50% (7/14). , стабилизация заболевания — у 14% (Mosse Y., 2017). В недавно опубликованном открытом, нерандомизированном исследовании фазы 2 с одним лекарственным средством частота объективного ответа на кризотиниб у пациентов с ALK + составила 50% (n = 6/12) Schöffski P., et al. Ланцет Респир Мед. 2018 июн; 6 (6): 431-441. DOI: 10.1016 / S2213-2600 (18) 30116-4. Epub 2018 15 апреля). Исследование было разработано с целью показать, может ли лечение ингибитором ALK кризотинибом улучшить исход педиатрической IMT в России.

    Морфофизиологический покой, прорастание и криоконсервация семян Aristolochia contorta

    Адамс К.А., Баскин Ю.М., Баскин К.С. (2005a) Застой признаков по сравнению с адаптацией у разобщенных реликтовых видов: эволюционные изменения в нарушении покоя семян и требованиях к прорастанию в субкладе Aristolochia подрода Siphisia (Piperales). Исследования семеноводства 15: 161–173. https://doi.org/10.1079/SSR2005207

    Adams C.A., Baskin J.M., Baskin C.C. (2005b) Сравнительная морфология семян четырех близкородственных видов Aristolochia подрода Siphisia (Aristolochiaceae, Piperales).Ботанический журнал Линнеевского общества 148: 433–436. https://doi.org/10.1111/j.1095-8339.2005.00402.x

    Акулова З.В., Александрова Е.К. (1996) Fam. Aristolochiaceae Juss. В кн .: Буданцев А.Л. (ред.) Растительные ресурсы России и сопредельных государств. Часть II. Дополнения к т. 1: 103–104. СПб, Мир и семья – 95.

    Алвес-да-Силва Д., Боргетти Ф., Томпсон К., Притчард Х., Грайм Дж. П. (2011) Недоразвитые зародыши и прорастание семян Aristolochia galeata.Биология растений 13: 104–108. https://doi.org/10.1111/j.1438-8677.2009.00302.x

    Артюкова Е.В., Козыренко М.М., Корень О.Г., Холина А.Б., Наконечная О.В., Журавлев Ю.Н. (2012) Жизнь на краю: различные способы сохранения на окраинах ареала некоторых дальневосточных видов. В: Галискан М. (ред.) Генетическое разнообразие растений: 349–374. Риека, InTech. https://doi.org/10.5772/35032

    Бай Б., Тубиана Д., Гендлер Т., Дегу А., Гаттерман Ю., Фейт А.(2015) Метаболические паттерны, связанные с сезонным ритмом выживания семян после обезвоживания проросших семян Schismus arabicus. BMC Plant Biology 15: 37. https://doi.org/10.1186/s12870-015-0421-9

    Баскин Дж. М., Баскин К. С. (2004) Система классификации покоя семян. Исследования семеноводов 14: 1–16. https://doi.org/10.1079/SSR2003150

    Беляев Е.А., Чистяков Ю. (2005) A. Sericinus montela. В кн .: Костенко В.А. (ред.) Красная книга Приморского края: Животные: 114–116.Владивосток, Апельсин.

    Берхано Перес Р. (2006) Biología de la воспроизводство mediterráneas de Aristolochia. Кандидатская диссертация, Университет Севильи, Севилья, Испания.

    Bliss BJ, Wanke S., Barakat A., Ayyampalayam S., Wickett N., Wall PK, Jiao Y., Landherr L., Ralph PE, Hu Y., Neinhuis C., Leebens-Mack J., Arumuganathan K ., Клифтон С.В., Максимова С.Н., Ма Х., de Pamphilis CW (2013) Характеристика базальных покрытосеменных Aristolochia fimbriata: потенциальная экспериментальная система для генетических исследований.BMC Plant Biology 13: 13. Https://doi.org/10.1186/1471-2229-13-13

    Chen S.Y., Kuo S.R., Chien C.T., Baskin J.M., Baskin C.C. (2007) Прорастание, поведение при хранении и криоконсервация семян Champereia manillana (Opiliaceae) и Schefflera octophylla (Araliaceae). Семеноведение и технология 35: 154–164. https://doi.org/10.15258/sst.2007.35.1.14

    Давалос А., Нуццо В., Блосси Б. (2015) Интерактивное влияние оленей, дождевых червей и неместных растений на пополнение редких лесных растений.Биологическая охрана 187: 173–181. https://doi.org/10.1016/j.biocon.2015.04.025

    Gois S.F., Almeida L.M. (2016) Análise da germinação de Aristolochia gigantea Mart. & Zucc. em differentes temperaturas e substratos. Revista Cultural e Científica do UNIFACEX. 14: 36–52.

    Гонсалес Ф.А. (1991) Заметки по систематике Aristolochia подсекции Hexandrae. Анналы ботанического сада Миссури 78: 497–503. https://doi.org/10.2307/2399576

    Гонсалес Ф.А., Стивенсон Д. (2002) Филогенетический анализ подсемейства Aristolochioideae (Aristolochiaceae). Revista de la Academia Colombiana de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales 26: 25–58.

    Hwang Sh., Kelly L.M., Gilbert M.G. (2003) Aristolochiaceae. В: Wu Z.Y., Raven P.H., Hong D.Y. (ред.) Флора Китая. 5: 246–269. Сент-Луис, Издательство Ботанического сада Миссури; Пекин, Science Press.

    Харкевич С.С. (1987) Aristolochiaceae. В: Харкевич С.С. (ред.) Сосудистые растения Советского Дальнего Востока. 2: 19–21. Ленинград, Наука.

    Холина А.Б., Воронкова Н.М. (2008) Сохранение генофонда дальневосточных растений методом криоконсервации семян. Бюллетень биологии 35: 262–269. https://doi.org/10.1134/S106235

  • 30060

    Холина А.Б., Воронкова Н.М. (2012) Криоконсервация семян некоторых лекарственных бобовых культур. Журнал ботаники 2012: ID 186891. https://doi.org/10.1155/2012/186891

    Куренцова Г.Е. (1968) Реликтовые растения Приморья. Ленинград, Наука.

    Maekawa L., Albuquerque M.C.F., Coelho M.F.B. (2010) Прорастание семян Aristolochia esperanzae О. Кунце при различных температурах и световых условиях. Revista Brasileira de Plantas Medicinais 12: 23–30. https://doi.org/10.1590/S1516-05722010000100005

    Мартин А.С. (1946) Сравнительная внутренняя морфология семян. Американский натуралист из Мидленда 36: 513–660. https://doi.org/10.2307/2421457

    Наконечная О.В., Нечаев В.А., Холина А.Б. (2010) Характерные природные местообитания Aristolochia contorta Bunge в Приморье (Россия). Вестник КрасГАУ 12: 35–41.

    Наконечная О.В., Нестерова С.В., Воронкова Н.М. (2012) Онтогенез Aristolochia contorta (Aristolochiaceae) в Приморском крае. Ботанический журнал 97: 1505–1515.

    Наконечная О.В., Горпенченко Т.Ю., Воронкова Н.М., Холина А.Б., Журавлев Ю.Н. (2013) Структура зародыша, признаки семян и продуктивность реликтовой лозы Aristolochia contorta (Aristolochiaceae). Флора 208: 293–297. https://doi.org/10.1016/j.flora.2013.03.010

    Наконечная О.В., Журавлев Ю.Н., Булгаков В.П., Корень О.Г., Сундукова Е.В. (2014) Род Aristolochia на Дальнем Востоке России (Aristolochia manshuriensis Kom., A. contorta Bunge). Владивосток, Дальнаука.

    Нечаев В.А., Наконечная О.В. (2009) Строение плодов и семян и пути распространения двух видов рода Aristolochia L.в Приморском крае. Бюллетень биологии 36: 393–396. https://doi.org/10.1134/S106235

    40116

    Нестерова С.В. (2008) Aristolochia contorta. В кн .: Красная книга Приморского края: Растения. 65. Владивосток, Апельсин.

    Николаева М.Г. (2001) Эколого-физиологические аспекты покоя и прорастания семян (обзор исследований за последнее столетие). Ботанический журнал 86: 1–14.

    Николаева М.Г., Тихонова В.Л., Далецкая Т.В. (1992) Длительное хранение семян дикорастущих растений: биологические особенности семян. Информация о сохранении генетических ресурсов. Пущино, Росс. Акад. Наук.

    Oh S.-Y., Pak J.-H. (2001) Карты распространения сосудистых растений в Корее. Сеул, Academy Book Publ. Ко.

    Охви Дж. (1965) Флора Японии. Вашингтон, Смитсоновский институт.

    Пенс В.К. (1991) Криоконсервация семян местных растений Огайо и родственных видов.Семеноведение и технология 19: 235–251.

    Rawat M.M.S., Thapliyal R.C. (2003) Эндогенный ритм прорастания семян Dendrocalamus strictus. Семеноведение и технология 31: 21–27. https://doi.org/10.15258/sst.2003.31.1.03

    Schmidt O.C. (1935) Aristolochiaceae. В: Энглер А., Прантл К. (ред.) Die natürlichen Pflanzenfamilien 16b: 204–242. 2-е изд. Лейпциг, В. Энгельман.

    Scalon S.P.Q., Sene P.A.L., Zatti D.A., Mussury R., Scalon Filho H. (2007) Воздействие погружения в воду, температуру, свет и субстрат на прорастание семян ципомиллионных (Aristolochia triangulares Cham. & Schl.). Revista Brasileira de Plantas Medicinais, Botucatu 9: 32–38.

    Соколова Е.А. (2010) Семья пасленовых. В кн .: Тахтаджан А.Л. (ред.) Сравнительная анатомия семян 7: 143–158. Санкт-Петербург, Наука.

    Тихонова В.Л. (1999) Длительное хранение семян. Российский журнал физиологии растений 46: 400–408.

    Воронкова Н.М., Нестерова С.В., Журавлев Ю.Н. (1996) Прорастание семян некоторых редких и исчезающих видов Приморского края. Растительные ресурсы 32: 51–60.

    Воронкова Н.М., Холина А.Б. (2010) Сохранение эндемичных видов с Дальнего Востока России с помощью криоконсервации семян. Бюллетень биологии 37: 496–501. https://doi.org/10.1134/S106235

    50092

    Zhang C.-Y., Wang X., Su T., Ma C.-M., Wen Y.-J., Шан М.-Й., Ли Х.-М., Лю Г.-Х., Цай С.-К. (2005) Новая аристолоховая кислота, аристололактам и почечные цитотоксические компоненты стебля и листьев Aristolochia contorta. Die Pharmazie 60: 785–788.

    Чжоу Дж., Се Г., Ян X. (2011) Энциклопедия традиционных китайских лекарств: молекулярные структуры, фармакологическая активность, природные источники и применения. Vol. 5: Изолированные соединения T – Z, ссылки, растения TCM и родственные им соединения. Берлин и Гейдельберг, Шпрингер-Верлаг.https://doi.org/10.1007/978-3-642-16741-6

    Чжоу Дж., Тейшейра да Силва Дж. А., Ма Г. (2014) Влияние дымовой воды и каррикина на прорастание семян 13 видов, произрастающих в Китае. Центральноевропейский биологический журнал 9: 1108–1116.

  • Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *