Вид лимита т0 т2 что это такое: Про «троение» лимитов в QUIK: Т0, Т1, Т2

Содержание

Про «троение» лимитов в QUIK: Т0, Т1, Т2

В своих материалах компания ARQA не один раз рассказывала об организации инфраструктуры QUIK для поддержки режима торгов Т+2 на Московской Бирже, однако все эти материалы выстраивались всегда с точки зрения брокера. Хотелось бы на их основе описать ту картинку, которую видит трейдер в своём терминале QUIK, т.к. вопросы про «троение лимитов» явно всё еще актуальны, и наверняка не всем известны на них ответы. В то же время наступит этот Т+2 уже фактически «завтра».

Как многие уже заметили, в таблицах лимитов терминала QUIK свежих версий появился новый столбец «Вид лимита», в котором отображаются значения Т0, Т1, Т2; одновременно с этим появились несколько лимитов по одному и тому же инструменту, различающиеся лишь значением в этой колонке. (Если у вас «несколько одинаковых лимитов» — просто включите отображение столбца «Вид лимита», именно в нём и будет различие.)

Что же это означает? А означает оно срок, к которому относятся обязательства, отраженные на данных лимитах:

  • Т0 — обязательства со сроком расчетов сегодня
  • Т1 — обязательства со сроком расчетов завтра
  • Т2 — обязательства со сроком расчетов послезавтра

Разные брокеры могут по-разному строить свои схемы учета, рассмотрим две «полярные».

1. Брокер предоставляет клиенту доступ только к режимам торгов Т+2. В этом случае, вообще говоря, в терминале QUIK достаточно видеть только одну позицию со сроком расчета «послезавтра», т.к. только она будет изменяться в результате сделок. Всю остальную бухгалтерию про сегодня и про завтра при необходимости брокер может сам как-то вести в своей бэк-офисной системе.

С точки зрения трейдера такой вариант отображения в QUIK будет выглядеть совершенно «как обычно»: купил — акции пришли на единственный лимит, продал — ушли. То, что фактические расчеты по операциям происходят только через 2 дня, будет видно лишь в отчетах брокера.

2. Брокер предоставляет трейдеру доступ как к режимам торгов Т+2, так и к оставшимся режимам торгов со сроком расчетов «сегодня». В этом случае становится осмысленным отображение всех трёх позиций: Т0, Т1 и Т2.

В такой схеме операции по режимам Т+2 будут отражаться только на лимитах Т2 обычным образом, а операции со сроком расчетов «сегодня» будут приводить к синхронному изменению лимитов Т0, Т1 и Т2 и вот почему.

Например, вносим деньги на счет. Т.к. деньги появляются уже «сегодня» — то они появляются на всех лимитах T0, T1 и T2, ведь если мы внесли их на сейчас счет — то на завтра они никуда не исчезают, а значит для «завтрашних» и «послезавтрашних» операций они должны быть доступны.

Теперь покупаем акции на режиме Т+2. Акции в этом случае зачислятся на счёт T2, с этого же счета спишутся деньги. При этом позиции Т0 и Т1 останутся неизменными, т.к. расчеты по этим проведенным операциям будут «потом».

На завтра все лимиты «сдвинутся», как бы «приблизившись» на 1 день. Т.е. остаток с Т2 попадёт на Т1, остаток с Т1 перейдёт на Т0, а лимиты Т2 на утро останутся неизменными (т.е. будут равны позиции на Т1).

В указанной схеме позиции на лимитах Т1 уже не изменяются по сделкам Т+2, однако они учитываются при контроле доступных средств в операциях на режимах Т0, ведь на завтра, когда наступит срок расчётов по этим обязательствам (изначально это были Т+2 операции, т.е. «послезавтрашние») средства для них надо будет иметь на счете.

PS
Для роботописателей. Поле limit_kind в разных интерфейсных функциях и структурах QPILE и Lua соотносится со значением колонки «Вид лимита» очень просто: откидываем букву Т — получаем цифровое значение limit_kind.
Т.е. 0 — Т0, 1 — T1 и т.д.

FAQ по режиму торгов Т+2 на Фондовом рынке в ИТС Quik

Возможности новой версии

Изменения в Рабочем месте QUIK 0 Возможности новой версии Доработки таблиц: В таблице «Клиентский портфель» добавлен расчет риск параметров для клиентских счетов срочного рынка, не использующих Модуль

Подробнее

Первый запуск программы QUIK.

Первый запуск программы QUIK. [v.1.0] В окне «Идентификация пользователя»: — Проверяем, что выставлен сервер соединения «Dragon-Capital [217.20.174.19:15100]». — В поле «Ваше Имя» вписываем Имя, введённое

Подробнее

Первый запуск программы QUIK.

Первый запуск программы QUIK. [v.1.0] Запускаем программу. На вопрос «Зчитування особистого ключа»: Выбираете Диск, где у вас хранится ЭЦП (созданная в «ИВК»), вводите пароль, который использовался при

Подробнее

Презентация по работе с системой QUIK

«Услуга по совершению внебиржевых сделок РЕПО (ОТС-РЕПО)» Презентация по работе с системой QUIK Управление розничного брокерского обслуживания и поддержки сети продаж Апрель 2012 года Ввод заявки на сделку

Подробнее

Первый запуск программы QUIK.

Первый запуск программы QUIK. [v.2.0] Запускаем программу. На вопрос «Зчитування особистого ключа»: Выбираете Диск, где у вас хранится ЭЦП, вводите пароль, который использовался при создании Электронной

Подробнее

Руководство по программе. Scalper Lite

Руководство по программе Scalper Lite mycreditcard.ru 2011 СОДЕРЖАНИЕ Торговый привод Scalper Lite 1. Назначение и условия применения…3 2. Описание интерфейса…3 3. Настройка программы…4 3.1 Настройка

Подробнее

Портфели (детализация)

Портфели (детализация) Внимание для отображения данных в окнах «Портфели», «Детализация позиции», «Архив позиций» осуществляется ряд расчетных процедур в связи, с чем информация по результатам заключения

Подробнее

Модуль алгоритмической торговли Light

Модуль алгоритмической Руководство пользователя Версия 2.13 Содержание 1. Общие положения… 3 2. Таблица алгоритмических заявок… 4 2.1 Назначение таблицы… 4 2.2 Формат таблицы… 4 2.3 Настройка таблицы…

Подробнее

Новое в маржинальном кредитовании

Новое в маржинальном кредитовании Новые особенности совершения маржинальных и необеспеченных сделок Что изменяется? с 27 марта 2014 года Увеличения доступного плеча Плечо до трех по умолчанию для всех

Подробнее

Справка по проекту «РЕПО с ЦК»

Справка по проекту «РЕПО с ЦК» Описание изменений в торговой системе Режимы торгов. Предусматриваются следующие режимы торгов: «РЕПО с ЦК безадресное 1 день». «РЕПО с ЦК адресное». «Переводы». В режиме

Подробнее

Руководство пользователя

Работа с аналитическими выборками в web-клиенте «Единой информационно-аналитической системе сбора и свода отчетности Министерства финансов Российской Федерации» Руководство пользователя 2 СОДЕРЖАНИЕ 1.

Подробнее

ИНСТРУКЦИЯ ПОЛЬЗОВАТЕЛЯ SILVERLIGHT

ИНСТРУКЦИЯ ПОЛЬЗОВАТЕЛЯ SILVERLIGHT УСТАНОВКА ПРИЛОЖЕНИЯ Для установки версии Silverlight для стационарного компьютера «Торговой Платформы Цесна Капитал» на сайте www.tscapital.kz (рекомендуется использовать

Подробнее

Просмотр состояния портфеля

Просмотр состояния портфеля 2 В торговой системе QUIK доступен просмотр состояния денежных и бумажных позиций. Открыв окно «Состояние счета», Вы сможете: Ознакомиться с оценкой Вашей позиции по денежным

Подробнее

АО «КАЗАХСТАНСКАЯ ФОНДОВАЯ БИРЖА»

Приложение 1 к Протоколу заседания Правления от 27 сентября 2012 года 188 АО «КАЗАХСТАНСКАЯ ФОНДОВАЯ БИРЖА» У т в е р ж д е н о решением Правления АО «Казахстанская фондовая биржа» от 27 сентября 2012

Подробнее

Руководство пользователя Е-Trading

Руководство пользователя Е-Trading Москва 2017 Оглавление 1. Термины и сокращения… 3 2. Общие принципы работы… 4 3.2. Работа с формами валютных пар… 5 3.2.1. Добавление/удаление/замена валютной пары…

Подробнее

Возможности новой версии

Возможности новой версии Индикатор «Глубина рынка» Добавлен новый индикатор «Глубина рынка», отражающий объемы заявок в виде гистограммы. Подробное описание см. в п. 4.2.15 Раздела 4 «Работа с графиками»

Подробнее

ИЗМЕНЕНИЯ В ВЕРСИИ 2.33 ТОРГОВОЙ СИСТЕМЫ

s Торговая система. Версия 2.33 РУКОВОДСТВО ПОЛЬЗОВАТЕЛЯ торговой системы ИЗМЕНЕНИЯ В ВЕРСИИ 2.33 ТОРГОВОЙ СИСТЕМЫ В новой версии системы торговой системы 2.33 имеются следующие изменения по сравнению

Подробнее

Модуль Автоследования

Модуль Автоследования Версия 2.0 Содержание 1. Общие положения… 2 2. Основные функции программы… 3 2.1 Таблица «Стратегии»… 3 2.2 Таблица «Состав стратегии»… 5 2.3 Таблица «Подписчики стратегии»…

Подробнее

Правила маржинального кредитования

Правила маржинального кредитования Новые требования расчета маржинального кредитования С 27.03.2014 изменились принципы маржинального кредитования для всех клиентов. Основание: Приказ ФСФР РФ 13-71/пз-н

Подробнее

Изменения в Рабочем месте QUIK

Программный комплекс QUIK фронт-офисная система прямого доступа Изменения в Рабочем месте QUIK Версия 6.15.0 ARQA Technologies, октябрь 2014 Возможности новой версии 1. Для клиентов, работающих по схеме

Подробнее

Необеспеченные сделки

Smart Bank for Smart Business Умный банк для умного бизнеса Необеспеченные ноябрь 2017 Общество с ограниченной ответственностью «Экспобанк» Генеральная лицензия ЦБ РФ 2998 Адрес местонахождения и почтовый

Подробнее

GoInvest торговый терминал для ipad и Android

GoInvest торговый терминал для ipad и Android GoInvest торговый терминал для ipad и планшетов на базе ОС Android. Данное приложение позволяет осуществлять все привычные операции по портфелю, просматривать

Подробнее

ПРОДУКТ КОМПАНИИ ITINVEST

ПРОДУКТ КОМПАНИИ ITINVEST SmartX собственная разработка компании ITINVEST, мощный и интеллектуальный торговый терминал, который совмещает в себе интуитивно понятный для всех начинающих интерфейс и функционал

Подробнее

ПРОДУКТЫ И ВНЕБИРЖЕВЫЕ ПФИ Изменения:

Инструкция по чтению отчета СТРУКТУРНЫЕ ПРОДУКТЫ И ВНЕБИРЖЕВЫЕ ПФИ Изменения: Дата изменения Описание изменения 27.03.2013 В раздел 2. Задолженности / Обязательства клиента перед Брокером: добавлены новые

Подробнее

Руководство пользователя

Руководство пользователя Рабочее место пользователя Программного комплекса QUIK фронт-офисной системы прямого доступа Версия 7.6 Раздел 1. Подготовка к работе 1.1 Общие сведения… 2 1.2 Требования к оборудованию…

Подробнее

Возможности новой версии

Возможности новой версии Изменения в графиках 1. Для построения вертикальной шкалы дополнительно к прежнему автоматическому алгоритму и возможности задать шаг шкалы вручную добавлена возможность использовать

Подробнее

webquik Руководство пользователя Версия 5.2.0

webquik Руководство пользователя Версия 5.2.0 ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ РАБОТЫ ИНТЕРФЕЙС WEBQUIK Интерфейс рабочего места пользователя системы webquik выглядит следующим образом: В заголовке окна браузера отображается

Подробнее

Модуль алгоритмичеcкой торговли

Модуль алгоритмичеcкой торговли Версия 3.1 Содержание 1. Общие положения… 5 2. Таблица алгоритмических заявок… 6 2.1 Назначение таблицы… 6 2.2 Формат таблицы… 6 2.3 Настройка таблицы… 13 2.4

Подробнее

Руководство пользователя

Руководство пользователя Рабочее место пользователя Программного комплекса QUIK фронт-офисной системы прямого доступа Версия 7.16 Раздел 1. Подготовка к работе 1.1 Общие сведения… 2 1.2 Требования к

Подробнее

Рабочее место QUIK Android X

Рабочее место QUIK Android X Руководство пользователя Версия 1.1 Содержание 1. О приложении… 3 2. Начало работы… 3 2.1 Требования к оборудованию и программному обеспечению… 3 2.2 Установка приложения…

Подробнее

Торговля фьючерсами в КИТ Финанс Брокер

Торговля фьючерсами в КИТ Финанс Брокер Оглавление Определение фьючерса Открытие и поддержание позиции Расписание торгов на срочном рынке Спецификация фьючерсного контракта Порядок исполнения фьючерсных

Подробнее

ЕДИНЫЙ БРОКЕРСКИЙ СЧЁТ

ЕДИНЫЙ БРОКЕРСКИЙ СЧЁТ Торгуйте с комфортом В жизни всегда есть место открытию open-broker.ru СОДЕРЖАНИЕ Что такое «Единый брокерский счёт»?…3 Ведём учёт в одном портфеле…4 Позволяем торговать под

Подробнее

Возможности новой версии

Возможности новой версии 1. Для графиков добавлена возможность использования линий подсветки и градиентной заливки: в свойствах графика для параметра «Вид графика» добавлены значения «Линия с подсветкой»

Подробнее

Раздел 3. Просмотр информации

Раздел 3. Просмотр информации 3.1 Создание окна… 4 3.2 Таблица текущих торгов… 8 3.3 Таблица обезличенных сделок… 17 3.4 Таблица котировок… 21 3.5 Состояние счета… 32 3.6 Таблица заявок… 57

Подробнее

банковские услуги юридическим и частным лицам

Правовая информация

Условия использования данного интернет-сайта

Указанные ниже условия определяют порядок использования данного интернет-сайта. Пользуясь доступом к этому интернет-сайту (в том числе к любой из его страниц) Вы, тем самым, соглашаетесь соблюдать изложенные ниже условия в полной мере.

Обращаем Ваше внимание, что если Вы уже являетесь клиентом ООО «Экспобанк», то настоящие условия следует применять совместно с положениями и требованиями, определенными в соответствующем договоре между Вами и ООО «Экспобанк». Просим принять во внимание, что все продукты и услуги ООО «Экспобанк» предоставляются Вам на основании соответствующих договоров.

ООО «Экспобанк» оставляет за собой право изменить настоящие условия в любое время без предварительного уведомления пользователей данного интернет-сайта путем внесения необходимых изменений в настоящие условия. Продолжая использовать доступ к данному интернет-сайту (в том числе к любой из его страниц) Вы, тем самым, подтверждаете Ваше согласие соблюдать все изменения в настоящих условиях.

Доступ к сайту

ООО «Экспобанк» имеет право по своему усмотрению в одностороннем порядке ограничить доступ к информации, содержащейся на данном интернет-сайте, в том числе (но, не ограничиваясь) если есть основания полагать, что такой доступ осуществляется с нарушением настоящих условий.

Обращаем Ваше внимание, что данный интернет-сайт разработан таким образом, и его структура подразумевает, что доступ к интернет-сайту и получение соответствующей информации должны начинаться со стартовой страницы интернет-сайта. В этой связи, доступ к любой странице этого интернет-сайта посредством прямой ссылки на такую страницу, минуя стартовую страницу данного интернет-сайта может означать, что Вы не увидите важную информацию о данном интернет-сайте, а также условия использования этого интернет-сайта.

Авторские права

Информация, содержащаяся на данном интернет-сайте, предназначена только для Вашего личного использования. Запрещается сохранять, воспроизводить, передавать или изменять любую часть данного интернет-сайта без предварительного письменного разрешения ООО «Экспобанк». Разрешается распечатка информации с данного интернет-сайта только для Вашего личного использования такой информации.

Продукты и услуги третьих лиц

В случае если на данном интернет-сайте находятся ссылки на интернет-сайты третьих лиц, такие ссылки не являются поддержкой, продвижением, либо рекламой со стороны ООО «Экспобанк» продуктов или услуг предлагаемых на таких интернет-сайтах третьих лиц. Вы самостоятельно несете всю ответственность, связанную с использованием Вами указанных ссылок для доступа к интернет-сайтам третьих лиц. ООО «Экспобанк» не несет ответственности или обязанности за содержание, использование или доступность таких интернет-сайтов третьих лиц или за любые потери или ущерб, возникающие в результате использования таких интернет-сайтов третьих лиц. ООО «Экспобанк» не проверяет, не гарантирует и не несет ответственности за точность и корректность информации, содержащейся на таких интернет-сайтах третьих лиц.

Данный интернет-сайт может содержать материалы и информацию, предоставленные третьими лицами. ООО «Экспобанк» не несет ответственности или обязанности за точность и корректность таких материалов и информации.

Третьим лицам запрещается размещать ссылки на данный интернет-сайт в других интернет-сайтах или размещать ссылки в данном интернет-сайте на другие интернет-сайты без предварительного получения письменного согласия ООО «Экспобанк».

Отсутствие оферты

Никакая информация, содержащаяся на данном интернет-сайте, не может и не должна рассматриваться в качестве предложения или рекомендации о приобретении или размещении любых инвестиций или о заключении любой другой сделки или предоставлении инвестиционных советов или оказании услуг.

Отсутствие гарантий

Принимая во внимание, что ООО «Экспобанк» предпринимает и будет предпринимать все разумные меры для обеспечения аккуратности и достоверности информации размещенной на данном интернет-сайте, следует учитывать, что ООО «Экспобанк» не гарантирует и не принимает никаких обязательств (прямых и косвенных) по отношению к точности, своевременности и полноте размещенной на данном интернет-сайте информации.

Оценки, заключения и любая другая информация, размещенные на данном интернет-сайте следует применять только в информационных целях и только для Вашего персонального использования (принимая во внимание порядок изменения настоящих условий, изложенный в начале).

Никакая информация, размещенная на данном интернет-сайте, не может и не должна рассматриваться в качестве инвестиционного, юридического, налогового или любого другого совета или консультации, и не предназначена и не должна использоваться при принятии каких-либо решений (в том числе инвестиционных). Вам следует получить соответствующую специфическую профессиональную консультацию, прежде чем принять какое-либо решение (в том числе инвестиционное).

Ограничение ответственности

ООО «Экспобанк» ни при каких обстоятельствах не несет ответственности или обязательств ни за какой ущерб, включая (без ограничений) ущерб или потери любого вида вследствие невнимательности, включая (без ограничений) прямые, косвенные, случайные, специальные или сопутствующие убытки, ущерб или расходы, возникшие в связи с данным интернет-сайтом, его использованием, доступом к нему, или невозможностью использования или связанные с любой ошибкой, несрабатыванием, неисправностью, компьютерным вирусом или сбоем оборудования, или потеря дохода или деловой репутации, даже в тех случаях, когда в явно выраженной форме Вам было сообщено о возможности таких потерь или ущерба, возникших в связи доступом, использованием, работой, просмотром данного интернет-сайта, или размещенных на данном интернет-сайте ссылок на интернет-сайты третьих лиц.

ООО «Экспобанк» оставляет за собой право изменять, приостанавливать или прекращать временно или на постоянной основе работу данного интернет-сайта или любой его части с предварительным уведомлением или без предварительного уведомления в любое время по своему усмотрению. Вы подтверждаете и соглашаетесь, что все изменения, приостановление или прекращение работы данного интернет-сайта не влекут возникновения каких-либо обязательств перед Вами со стороны ООО «Экспобанк».

Регулирующее законодательство

Настоящие условия регулируются законодательством Российской Федерации. Вы подтверждаете и соглашаетесь, что все вопросы и споры, возникающие в связи с данным интернет-сайтом и условиями его использования подлежат рассмотрению в юрисдикции Российской Федерации.

Данный интернет-сайт разработан для использования в Российской Федерации и не предназначен для использования любым физическим или юридическим лицом, находящимся в юрисдикции или стране, где публикация информации, размещенной на данном интернет-сайте или возможность доступа к данному интернет-сайту или распространение информации с помощью данного интернет-сайта или иное использование данного интернет-сайта нарушают законодательство такой юрисдикции или страны. В случае если Вы решили воспользоваться доступом к информации, размещенной на данном интернет-сайте, обращаем Ваше внимание, что Вы самостоятельно несете ответственность за соблюдение применимых местных, государственных или международных законов, и Вы самостоятельно несете ответственность за любое использование информации размещенной на данном интернет-сайте вне юрисдикции Российской Федерации. В случае возникновения какого-либо вопроса, связанного с применением регулирующего законодательства, рекомендуем Вам обратиться за помощью к Вашему консультанту по юридическим вопросам.

Как посмотреть открытые позиции в квик (QUIK)

Всем добрый день!

Решил написать коротенький пост для начинающих, в котором расскажу о том, как посмотреть открытые позиции в терминале квик (QUIK) при торговле фьючерсами и акциями. Итак, поехали.

Читайте также “быстрая настройка терминала QUIK“.

Открытые позиции на фьючерсах

При торговле фьючерсами нам необходимо построить табличку, с названием «позиции по клиентским счетам». Для этого нам необходимо в верхнем углу экрана кликнуть “создать окно”, после чего выбрать из выпадающего списка “все типы окон”. Затем найти необходимый пункт в списке.

Далее кликаем правой кнопкой мыши на табличку и нажимаем редактировать. Добавляем доступные параметры и сохраняем настройки. Лично я выбираю все параметры.

Теперь в данной табличке в графе “текущие чистые позиции” мы можем следить за нашими открытыми позициями.

Если в данной колонке указано 0 (либо цифры вообще отсутствуют), значит открытых позиций нет. Если мы видим значение -1, значит у нас открыта короткая позиция, если +1, то длинная. Всегда проверяйте данную графу, так как по неопытности довольно часто случается, что сделка закрыта не полностью и часть контрактов продолжает висеть. Чтоб не получилось так, что при следующем запуске терминала мы обнаружили отрицательную маржу на счете. Ну или положительную, если повезет 🙂

Открытые позиции на акциях

Посмотреть открытые позиции по акциям можно в таблице “состояние счета”. Для этого кликаем в верхнем углу экрана на пункт “создать окно” и затем выбираем “состояние счета”. В этой таблице мы также можем увидеть цену, по которой мы вошли в сделку, объем под который был выполнен вход и другие полезные параметры. Здесь все достаточно просто, думаю вы разберетесь, если будут какие-нибудь вопросы, то оставляйте в комментариях.

За нашей текущей прибылью/убытком по бумагам можно также следить в таблице “клиентский портфель”. Добавляется она через все тот же пункт “все типы окон”, как и таблица для фьючерсов. Тут тоже все достаточно просто. Хочу лишь заострить внимание на пункте “вид лимита”. Нам необходим лимит “Т2”.

Вид лимита: Т0,Т1 и Т2

Вообще, есть три лимита: Т0, Т1 и Т2. Расскажу о них очень коротко, так как полную информацию об этом можно найти на сайте Московской бирже. Я выделю основные моменты, которые необходимо знать трейдеру.
Итак, что означают эти лимиты? А означают они срок, к которому относятся обязательства:

  • Т0 — обязательства со сроком расчетов сегодня.
  • Т1 — обязательства со сроком расчетов завтра.
  • Т2 — обязательства со сроком расчетов послезавтра.

А так как режим торгов на бирже Т+2, то на лимиты T0 и Т1 можно не обращать внимание. Смотреть необходимо только лимит “Т2”. В нем и будут отображаться наши актуальные позиции. Поэтому не пугайтесь если вы обнаружите изменение в графе “прибыль/убыток” в лимите “Т1” на сегодняшний день, при этом не совершив ни одной сделки, так как это расчеты со вчерашнего дня.

На этом буду заканчивать, надеюсь данная статья оказалась для вас полезной. Если возникли вопросы, оставляйте в комментариях. Подписывайтесь в группу вконтакте и на мой канал YouTube. Всем пока!

С уважением, Станислав Станишевский.


Заблудились на сайте? Карта сайта.

Хотите больше информации? Обучение трейдингу.

 

Страница не найдена

А Армавир Амурск Ангарск

Б Бикин Благовещенск Белогорск Биробиджан

В Владивосток Ванино Вяземский Волгоград Волжский Вологда Воронеж

Д Де-Кастри

Е Екатеринбург

И Иркутск

К Казань Краснодар Красноярск Комсомольск-на-Амуре Калининград Киров

М Москва

Н Нефтекамск Новороссийск Находка Николаевск-на-Амуре Нижний Новгород Новосибирск Нижний Тагил

О Октябрьский Омск

П Петрозаводск Переяславка Пермь

Р Ростов-на-Дону Рязань

С Санкт-Петербург Стерлитамак Сегежа Сыктывкар Сочи Ставрополь Советская Гавань Солнечный Соловьевск Самара Саратов

Т Туймазы Тында Томск Тюмень

У Уфа Ухта Уссурийск

Х Хабаровск Хор

Ч Чегдомын Челябинск Чита

Ю Южно-Сахалинск

когда ждать ребаланс, какие ближайшие планы и другое

На днях была проведена онлайн-трансляция с Орком-Подкастером и представителями команды Lost Ark, где прозвучали ответы на самые часто задаваемые вопросы игроков.

Ниже вы можете найти текстовую расшифровку этого видео.

О — Орк-Подкастер

А. И. — Андрей Илюшин

Е. С. — Екатерина Соколова

А. И.: Одна из особенностей апдейта состоит в том, что всем игрокам становится доступен квест на снятие завесы Процея, на возможность ее пройти, проплыть опасным океаном и оказаться в океане Процея, открыть для себя новый континент Рохэндель и новые острова.

О: Что нас может поджидать за завесой Процея?

А. И.: Помимо того, что здесь живут новые морские обитатели, встречаются ранее недоступные точки, в которых можно найти новые предметы, еще есть пиратские суда, причем не просто маленькие кораблики, а настоящие проклятые огромные парусники.

О: Каким образом эти Корабли-призраки добываются? По какому принципу они будут выпадать — с определенным шансом или в виде аукциона разыгрываться после прохождения рейда?

А. И.: Насколько я знаю, это будет шансовка — для каждого своя. На самом деле шанс не очень высок, и выдавать даже один корабль на весь рейд может быть довольно дисбалансно. Сам океан Процея характерен тем, что здесь больше редких точек, например, для добычи грузов ныряльщиками, поднятия редких сундуков. Встречаются так называемые «золотые споты», на которых совсем интересный дроп падает.

О: Будет ли остров Рохэндель сразу озвучен?

А. И.: Да.

Е. С.: Кроме того, что мы завезем озвучку профессиональных актеров, туда еще войдут реплики, записанные победителями конкурса озвучания. Будет интересно.

О: Будут ли в игру вводиться ускорители прокачки снаряжения 400–515-го уровней, т. е. Т2 сет? Как это было сделано для Т1. И тот же вопрос о Т2,5 в дальнейшем.

А. И.: Такой план есть. Не просто так был ускорен Т1. В дальнейшем запланировано ускорять и Т1 фазу, и Т2, Т2,5 фазы. Это может быть частично сделано через введение ивентов. В дальнейшем, когда актуальной станет уже Т3 фаза с введением континента Йон, естественно, мы хотим давать возможность новым игрокам, которые только пришли в игру, быстрее приходить к новому, актуальному контенту.

О: Будет ли ребаланс классов в этом обновлении? Если нет, то когда ближайший?

А. И.: Не будет. Ближайший будет, скорее всего, в начале второго квартала (примерно апрель-май этого года).

О: Будет ли новый календарь?

А. И.: Нового календаря пока что тоже не завезут. Прошлый у нас подходит к концу. Сейчас изучаем возможности засчитать игрокам лишний день, который у нас некоторые пользователи потеряли из-за того, что была длительная профилактика. Это требует некоторых затрат ресурсов и исследовательских мощностей разработчиков. В том числе поэтому следующий календарь у нас выйдет с некоторой задержкой. Как вы знаете, мы используем календарь не совсем так, как в Корее. Поэтому не нужно ожидать, что календари будут выходить один за другим.

О: Будут ли ивенты в ближайшее время? Когда и какие?

А. И.: Ивенты будут. Что такое «ближайшее время»? У всех это восприятие разное. Заранее говорить про ивенты, которые мы не установили к себе на сервер и не протестировали, не имеет смысла, потому что это задает лишние ожидания, которые в итоге по техническим причинам могут не оправдаться. Да, мы помним, что игроки хотят проходить ивенты, хотят новый, необычный контент, больше наград, и, естественно, обсуждаем это с разработчиками игры. Как только у нас появится, что рассказать — обязательно расскажем. Здесь как с апдейтами. Как только в апдейте появляется полностью доработанная и готовая механика, мы про нее рассказываем. Вот то же самое с ивентом. Мы довольно точно представляем, что бы мы хотели поставить, но рассказывать об этом сильно заранее было бы несколько странно.

О: Будут ли в продаже костюмы из набора раннего доступа?

А. И.: Мы со Smilegate RPG обсудим, как это можно реализовать.

О: Будет ли Т3 Акрасиум в игре?

А. И.: Интересный вопрос. Игроки, которые плотно следят за Кореей, знают, что в Т3 фазе есть свои ресурсы, которые используются для заточки, но это не совсем Акрасиум. Там добавляются два определенных важных изменения. Во-первых, то, что ресурсы в Т3 фазе частично передаются. Ими можно торговать, в отличие от Акрасиума. Во-вторых, существует возможность неудачно усилить свой предмет. Это немного отличается от механики Акрасиума, который, в свою очередь, дает гарантию того, что ты точно усилишь свой предмет при определенном количестве Акрасиума. Но при этом его нельзя передавать. То есть заточка будет, ингредиенты будут, но это уже не Акрасиум.

О: Добавят ли вместе с Рохэнделем возможность покупать слоты для персонажей на аккаунте?

А. И.: Так много людей, которые выкачали уже по шесть персонажей? Нет, с Рохэнделем такая функция не предусмотрена. Но мы обсуждаем ее введение в следующем апдейте — под Мастера Копья.

О: Будет ли новая экипировка в обновлении? Если да, то какой ГС будет нужен для нее?

А. И.: Давайте немного поговорим про ГС. Когда мы рассказывали про апдейт игрокам, то отмечали, что, во-первых, для прохождения завесы Процея, чтобы попасть туда, где мы сейчас находимся (в океан Процея), нужно не меньше 305 ГС. 380 — это планка прохождения таможни в Рохэндель. Чтобы пройти завесу, нужно 305 ГС. Даже самые малыши, которые только дошли до 50-го уровня и чуть-чуть проточили только Т1 экипировку, смогут пройти квест на завесу и посетить некоторые острова, подобывать в золотых месторождениях ресурсы в море. Чтобы попасть в Рохэндель, нужен 380 ГС. А в данже, который называется «Храм стихий» и открывается в процессе прохождения сюжетки, можно будет получить те же два предмета, они не точатся. Примерно 393 ГС. Это на легком уровне данжа. На сложном уровне этого же данжа («Храма стихий»), можно получить уже «точащиеся» предметы, которые будут точиться от 465 до 520 ГС. При проточке используется Т2 Акрасиум. На самом деле это эквивалент предметов с 4-го уровня сложности Хранителей. А еще в Тайном саду есть финальный данж, из которого падают предметы Т2,5, они точатся до 555. То есть по факту есть два «точащихся» сета и два не «точащихся» сета. Все это помогает чуть-чуть быстрее прокачать свой гирскор, готовиться к вводу Йона.

О: Как получить Косатку и Ледокол?

А. И.: Косатку можно будет посмотреть в магазине, если нажать F4 и перейти наверху во вкладку «Особое».

О: Хорошо, магазин порекламировали. Но как ее получить-то? Или это и был ответ?

А. И.: Это и был ответ. Что касается Ледокола, он тоже есть в магазине. Он продается за синие кристаллы. Так что можно нафармить кристаллы в игре — и купить себе новый облик Ледокола.

О: Расскажите, пожалуйста, о данжах Рохэнделя. Правда ли, что с них аналог Т2,5 падает?

А. И.: На самом деле про это мы уже поговорили. Да, падает.

О: Какие награды будут за прохождение новых лабиринтов Рохэнделя?

А. И.: На самом деле можно было посмотреть у NPC. Дело в том, что за прохождение с некоторым шансом падают печати, скопив определенное количество которых, можно купить себе награду по выбору. За один из лабиринтов можно получать Акрасиум, кроме того, можно обменивать печати на маунтов и руны. В целом там довольно разнообразный ассортимент, который я не помню наизусть.

О: В планах ли у вас выпускать батлпасы?

А. И.: Да, есть. Обсуждаем это, есть несколько идей. Решаем с разработчиками вопросы про возможные награды, про то, как это в целом будет все работать, насколько это можно интегрировать в игру или же это будет исключительно батлпас на сайте игры. Изучаем разные возможности, работаем.

О: Как вы планируете развивать GvG и гильдейский контент?

А. И.: 22 января мы поставили апдейт, который довольно сильно актуализировал гильдии в игре: добавились битвы за Сильмаэль, режим ликвидации, режим битв гильдий, появилась возможность прокачивать уровень гильдий. Пока, как мы видим, игроки активно этим увлечены, ходят на те мероприятия, зарабатывают кристаллы Сильмаэля. Нам хочется помогать гильдиям набирать игроков к себе. Мы общаемся со Smilegate RPG по поводу того, как можно улучшить интерфейсы представления своих гильдий внутри игры. В то же время, со своей стороны, как мы можем помочь. Может быть, создать какой-то механизм для того, чтобы игроки могли на сайте подавать заявку в гильдию или лидеры гильдий могли просматривать открытый профиль других игроков на сайте. Примерно в этом направлении думаем. Естественно, многое зависит от того, какую информацию позволит забирать игра и насколько мы сможем такой функционал интегрировать непосредственно с игрой. Мысли пока примерно такие.

О: Когда уберут или уменьшат временные штрафы при выходе из гильдии?

А. И.: Вопрос интересный, потому что мы слышим отзывы игроков, которые говорят: «Очень большой откат после того, как я вышел из гильдии». На самом деле эта настройка приехала к нам из Кореи. В Корее она работает, и нам довольно сложно предсказать, что случится, если мы ее отключим. Другое дело, что эта же настройка применяется в ситуации, когда игрока выкидывают из гильдии. Вот это — неправильная история, на наш взгляд. Мы сейчас общаемся, думаем, как можем поменять систему, чтобы штраф применялся только при добровольном выходе из гильдии. Может быть, уменьшим его. Но пока нет информации, в каком апдейте это точно изменится.

О: Планируется ли введение двух режимов на Хранителей — heroic и normal?

А. И.: Это довольно интересная история. В Корее сначала было два режима — обычный и простой. Совсем недавно Smilegate RPG у себя изменила эту систему и добавила режим челленджа, когда игрок балансируется под определенный уровень гирскора вне зависимости от его предметов и убийство боссов зависит не столько от силы персонажей, сколько от «прямоты рук», от слаженности командных действий. Мы сейчас обсуждаем возможность введения именно второй апгрейженной системы у нас. Мы, вероятно, не будем вводить промежуточную историю с простой доской, а введем все вместе, но сроков, к сожалению, пока нет. Как только появятся, как только к нам приедет апдейт с этими изменениями, будем публиковать.

О: Будет ли введен выбор пола?

А. И.: Корейцы у себя анонсировали подобную фичу недавно, примерно в январе. Снятие гендерлока. Интересная особенность, что показали они только двух персонажей (два архетипа). Вопросы «как?» и «с кого?» снимут гендерлок, позволят выбирать пол — это отдельная история, которую даже мы не знаем, потому что очень многое завязано на планах Smilegate RPG. Кстати, ответ на вопрос такой: он будет, его уже анонсировали разработчики, но в каком виде и когда его введут — все полностью зависит от них. Они у себя это как-то реализуют, введут, мы дружно с игроками на это посмотрим и скажем: «Круто получилось, берем себе».

О: Расскажите больше про Косаток.

А. И.: Косатки интересны тем, что их можно применить для любого корабля, и даже для Корабля-призрака.

О: То есть можно маскировать корабль, получается? Когда не знаешь, что именно это за Косатка на тебя плывет.

А. И.: Ну не то чтобы это тебе дало какое-то сильное преимущество… особенность Косатки — это скорость плавания, если не нагружать ее сильно моряками, то на ней можно гораздо быстрее добраться до нужного острова. Это просто приятно.

Е. С.: Кстати, заниматься всеми морскими делами можно и на Косатке.

А. И.: На самом деле, не всеми делами. Например, собирать корабли, желтые точки и выживших за бортом ты сможешь, а ловить особо не сможешь. Хотя, казалось бы, к Косатке очень легко прикрепляется лебедка и дальше ловится со дна все что угодно.

О: Будет ли в ближайшие полгода-год контент, эксклюзивный для российских серверов?

А. И.: Да, будет. Запланировали и уже работаем.

О: Хорошо. Будет ли возможность смены класса?

А. И.: Здесь примерно та же самая история, как со сменой пола. Мы сильно зависим от функционала Smilegate RPG. У них пока такой возможности я не видел. Пока у них не реализовано, у нас такое чисто технически появиться не может.

О: Хорошо. Когда появится новый класс?

А. И.: Новый класс у нас уже анонсирован в плане в марте. Это будет Мастер Копья.

О: Будет ли введен билет для прокачки до 50-го уровня?

А. И.: Да, эту штуку мы тоже планируем вводить в марте вместе с новым классом.

О: И может быть, еще какая-то возможность быстрой прокачки твинков будет введена?

А. И.: Если говорить про игровые возможности, то мы планируем добавить в торговца безделушками возможность обменивать Акрасиум — можно будет со своей основы сливать Акрасиум в паки и передавать на твинков через Хранилище аккаунта.

О: Ну и финальный вопрос, который я вам задам сегодня. Будут ли в ближайшее время петы в ивентах? И что делать тем, кто пропустил Эгзимона в феврале?

А. И.: Честно говоря, для тех, кто пропустил Эгзимона в феврале, у нас ответа нет. Как вариант рассматриваем добавлять Эгзимона в грядущие ивенты, но, к сожалению, финального решения еще не приняли.

О: Ну что ж, тогда, получается, все. Спасибо вам за то, что показали мне и народу Рохэндель, который будет в ближайшем обновлении.

Е. С.: Спасибо за компанию!

Вопросы и ответы в стрим-студии

Е. С.: Вопрос первый. Крохотный Акрасиум можно передавать твинкам?

А. И.: Как мы говорили под конец ивента — да, такая возможность сейчас обсуждается, она, вероятно, будет добавлена в мартовском апдейте для того, чтобы ускорить прокачку твинков, своих новых персонажей, чтобы дать большему количеству игроков попробовать новые классы.

Е. С.: Еще вопрос. Когда будет пятая вкладка гвардов? Я думаю, речь идет о Хранителях.

А. И.: Да, я понял. Она сейчас тоже планируется на март, но у нас есть опасения, которые мы обсуждаем со Smilegate RPG. С пятых гвардов почти ничего полезного не падает в условиях того, что у нас нет гирскорной бижутерии. И есть опасения, что этот контент будет не очень актуальным, и он точно не сможет быть актуальным после введения Йона с его гвардами и данжами. Поэтому пока нет решения о введении, потому что нет понимания того, насколько хочется и насколько есть техническая возможность актуализировать этот контент, может быть, добавить какие-то награды, которые сохранят его актуальность подольше.

Е. С.: Люди переживают. Будут ли новые внешки, петы и маунты?

А. И.: Обязательно будут.

Е. С.: Расскажи, какие будут внешки, петы и маунты.

А. И.: Хорошо, сейчас бы вспомнить… Что касается февральского апдейта, который мы поставим 26 февраля, будет добавлен новый пет — это Чайка в четырех расцветках. Будут добавлены 3 наряда — наряды Адмирала Акрасии. Мы их назвали Адмирал Южных, Западных, Северных морей в зависимости от расцветки. У этого костюма интересная особенность. У нас многие игроки спрашивают, добавим ли мы морской сет.

Е. С.: Расскажи подробнее про ситуацию с морским сетом.

Что касается морского сета как игровой механики, как возможности собирать предметы экипировки за прогресс с Душами Островов, то здесь мы во многом зависим от разработчиков игры, от Smilegate RPG. Мы много раз говорили перед ОБТ, эта возможность была отключена у нас в игре, потому что морской сет непосредственно самими разработчиками воспринимался как некий «шорткат», как возможность слишком быстро (незапланированно быстро) достигнуть высокого гирскора. Поэтому у нас они эту штуку отключили. В дальнейшем, когда они у себя сильно ушли в Йон, у них в принципе этот контент стал не очень актуален. Насколько я знаю, на трансляции в январе они у себя анонсировали в том числе доработку морского контента. Возможно, они у себя актуализируют морской сет, но пока для нашей локализации мы привезли морской сет в виде наряда.

Е. С.: Ты обогнал вопрос, он буквально дальше шел. Что будет с морским сетом? Введем ли мы его?

А. И.: Сам морской сет мы не введем, но внешность, которая заложена в него — да, будет доступна с установкой февральского обновления.

Е. С.: У нас остались маунты?

А. И.: Маунтов в февральском обновлении нет. Но запланировано несколько на следующий месяц. Вместо маунтов в февральском обновлении у нас изменение внешнего вида кораблей — Косатка в трех расцветках и Ледокол от йоновских умельцев.

Е. С.: Весь апдейт получился посвященным морю. Казалось бы, февраль, а у нас уже мечты о путешествиях морских.

А. И.: У нас моря опасные, тут не позагораешь.

Е. С.: Следующий вопрос. Будет ли обмен Т2 Акрасов на Т3 предметы?

А. И.: Это очень неожиданный вопрос. Насколько я помню, в Корее этой механики нет. Либо ее довольно долго не было. Но я понимаю, от кого этот вопрос может исходить. Его, скорее всего, задает игрок, который сейчас сидит в районе 545–550 ГС, понимает, что Йон еще довольно далеко, а заняться нечем. То есть понятно, плановая прокачка, Т2 Акрасиум у него, скорее всего, уже лежит в заначке, ему только осталось дождаться лимитов в следующую среду — и он возьмет 555, игра пройдена… но тут я немного заспойлерю. Мы сейчас со Smilegate RPG обсуждаем возможность введения механики, которая позволит получать ресурсы для прокачки Т3 предметов несколько раньше, нежели введение непосредственно самого Йона. Это такой небольшой спойлер, бонус к стриму. На самом деле почти ничего еще не известно, очень многие штуки еще не финализированы. Но в таком направлении развивается мысль, и хочется развивать проект дальше. Для некоторых игроков, которые уже достигли высокого гирскора, цели в игре начинают потихоньку теряться, и хочется помогать им дождаться Йона, при этом чтобы они не вхолостую тратили время внутри игры.

Е. С.: Будет ли система быстрого старта без вложений в игру?

А. И.: Мы ее добавим.

Е. С.: Это вопрос про билеты.

А. И.: Да, в Корее это две сильно связанные системы. Желтый билет там можно просто приобрести в магазине и прокачать 50-й уровень, взять определенный уровень гирскора и получить достаточно развитого персонажа. Есть другая система, которая за синие билеты (не продаются в магазине, они добываются в Корее по тем или иным ивентам). Мы у себя тоже будем их распространять через ивенты. К сожалению, не могу пока рассказать, через какие, потому что это еще не до конца согласовано внутри нашей команды. Пока нет точного понимания и стратегии того, как это будет работать. Но сама по себе система у нас будет добавлена. Техническая возможность распространять такие билеты тем или иным образом у нас будет вместе с установкой мартовского обновления.

Е. С.: Когда будет следующий PvP-турнир?

А. И.: Первый турнир у нас состоялся в декабре и был реализован командой ESpotrs, за это им большое спасибо, ребята нам очень помогали. Им тоже очень понравилось и они предложили нам помощь в организации дальнейших турниров. Сейчас у нас в активной фазе находится подготовка следующего PvP-турнира. Мы бы хотели, чтобы он был несколько масштабнее, чем предыдущий, декабрьский.

Е. С.: Уже похоже на киберспорт что-то, да?

А. И.: Да, похоже, но нам со своей стороны предстоит многое узнать про LOST ARK, про технические особенности игры, вопросы балансировки, матчинга команд. Будем продолжать проводить турниры в экспериментальном формате, но будем наращивать объемы, размеры, привлекательность и уже достаточно скоро анонсируем следующий.

Е. С.: Привлекательность, в том числе и за счет призов?

А. И.: Обязательно.

Е. С.: Ждите, мы уже достаточно скоро анонсируем новый PvP-турнир. Следующий вопрос. Будут ли добавлены новые уровни Наследия?

А. И.: Здесь тоже есть интересная история. Если нас сейчас смотрят некоторые игроки из активных гильдий, с представителями которых мы встречались в конце января в офисе (у нас была встреча за закрытыми дверями, мы обсуждали, кто какие проблемы видит в игре, что нравится, что не нравится, предложения активных игроков, как развивать дальше игру…), мы упоминали, что на тот момент обсуждения со Smilegate RPG о повышении уровня Наследия не было. Могу извиниться за обман в каком-то смысле. Это могло быть воспринято так, что еще долгое время изменения не будет. Нет, оно будет уже в февральском обновлении. Если коротко, то уровень наследия будет поднят до 100-го, будет ускорен сам прогресс по Наследию, причем на всех уровнях, не только до 50-го, но и все уровни от 50-го до 100-го будут браться довольно быстро. И там будут награды.

Е. С.: То есть сейчас ты уже раскрыл, что у нас будет повышение уровня наследия до 100-го и это случится уже 26 февраля.

А. И.: Совершенно так.

Е. С.: Отлично. Вопрос следующий. Можно ли будет продать Корабль-призрак и Косатку на аукционе за золото?

А. И.: Нет, такой возможности нет.

Е. С.: Вопросы уже подходят к концу. Мы сегодня бодро идем по ним. Будет ли изменен матчмейкинг?

А. И.: Хотелось бы уточнить, про какой из режимов идет речь. Потому что мы получаем запросы от игроков по разным матчмейкинг- и PvP-механикам. Есть, например, вопросы про матчмейкинг Сильмаэля. Некоторые гильдии, у которых выше 1300 гирскор, иногда не могут заматчиться, или часто получают автопобеду, или идут в балансный режим сражаться с новичками. Тут много своих тонкостей. Есть, например, истории о том, что кому-то не нравятся в PvP AFK-игроки или матчинг по рангам, по классам и т. д. Да, об этих проблемах мы слышим и обсуждаем их со Smilegate RPG. Это все не очень легко менять, потому что PvP в Корее имеет меньший приоритет, чем у нас. Smilegate RPG не очень много данных имеет о том, что и как можно улучшить, чтобы это действительно заработало так, как хочется, потому что матчмейкинг — это довольно тонкая история. Можно что-то поменять и сделать еще хуже. Возможно, у нас не будет способа протестировать заранее. Возможно, к нам приедут какие-то тестовые истории. Но пока мы не пришли к тому, что и где точно меняем.

Е. С.: Следующий вопрос. Я уверена, что многие игроки хотели бы протестировать сами все необычные, новые механики на ПТС и спрашивают, будет ли доступен ПТС для всех?

А. И.: Как правило, ПТС открывается массово тогда, когда нужно протестировать что-то массовое. Если бы речь шла про тестирование полностью новой системы матчмейкинга, когда нужно дать определенную нагрузку на сервер, чтобы были игроки с разным скилом и рангом, в таких ситуациях мы хотим и готовы открывать ПТС. Пока что таких механик, которые требовали бы массового тестирования, нет. У нас просто нет необходимости в том, чтобы приглашать большое количество игроков на ПТС.

Е. С.: Тоже животрепещущий вопрос, особенно в контексте подготовки к новому PvP-турниру. Когда наша версия догонит корейскую версию по балансу?

А. И.: Про баланс отвечал. Он не заложен в ближайшие два апдейта. Он, вероятно, у нас появится вместе с Йоном, примерно в апреле-мае. Пока о таких сроках идет диалог. Это будет, скорее всего, актуальный баланс Кореи, то есть, вероятно, февральская или мартовская версия. Так как мы недостаточно хорошо знаем, насколько у них плотно запланированы ребалансы дальше. Возможно, что на момент установки этой версии баланса у них выйдет совсем новая, поэтому говорить о том, что мы догоним, было бы странно. Но мы планируем установить ту версию, которая примерно у них сейчас.

Е. С.: Расскажи, пожалуйста, как мы будем догонять корейскую версию не только по балансу, но и по обновлениям в целом.

А. И.: Тут все тоже не до конца понятно, потому что да, мы догоняем потихоньку. Если сравнить время установки Йона, то мы сократим отставание минимум еще на месяц. Возможно, после установки Йона мы сможем быстрее сокращать отставания, потому что рейды Йона вводились в целом раз в полтора месяца. А мы, возможно, сможем их поставлять раз в месяц. Это пока довольно высокоуровневый план, нет четких дат. При этом, как уже не раз говорилось, мы следим за тем, как развивается основная масса игроков, какой сейчас средний гирскор, какая скорость его достижения, и пытаемся, с одной стороны, не давать тем, кто на максимальном гирскоре, скучать, но при этом и не создавать у тех, кто немного позади таких игроков, ощущение, что впереди еще огромная пропасть, «я никогда не догоню» и так далее. Здесь вопрос балансировки, чтобы основной массе игроков было комфортно. Чтобы они чувствовали свой прогресс и были новые цели в игре.

Е. С.: Еще один вопрос про билет, который мы собираемся вводить уже в марте. Какой конкретно ГС получит персонаж, который применит его?

А. И.: 385 гирскор.

Е. С.: Будет как раз комфортно ворваться во все высокоуровневые активности.

А. И.: Как раз в Рохэндель.

Е. С.: Правда. Вопрос про карточные битвы. Будут ли награды за повторное сражение? Например, перья Лазениса.

А. И.: Такое не планировали.

Е. С.: Будет ли у нас PvP 1 на 1? И дружеские матчи рейтинговые?

А. И.: Дружеский матч рейтинговый это, наверное, оверкилл? Ну, потому что не имеет большого смысла в целом какое-то соревнование, когда речь идет про дружеские матчи. Что касается 1 на 1, то точно не раньше, чем в Корее. Пока что в каком-то смысле этот мод нам заменяет «Ристалище». Но хочу сказать, что мы обсуждаем возможность проведения рейтинговых битв в режиме «Ристалища», а не «Арены».

Е. С.: Просто повторяется часто вопрос, какие будут внешки и когда?

А. И.: Про февральские внешки мы поговорили. В Корее есть морской сет (Т1, Т2, Т2,5), который в нашей версии не введен. Мы попросили Smilegate RPG взять 3D-модели этого сета и превратить в предметы внешнего вида для того, чтобы у наших игроков хотя бы была возможность примерить на себя образ морского волка и адмирала.

Е. С.: То есть эти внешки появятся уже в феврале?

А. И.: Да. Кроме того, у нас есть план введения предметов внешнего вида на будущее. Как видите, с ОБТ мы потихоньку расширяем ассортимент и не планируем останавливаться.

Е. С.: Спасибо. Вопросы уже подошли к концу. Наш стрим тоже завершается. Осталось сказать, что мы очень рады, что вы сегодня с нами. Надеемся, сможем встречаться с вами чаще, тем более по таким позитивным поводам, как большое контентное обновление, которое мы сами очень ждем. До встречи в Акрасии!

А. И.: Всем пока, ребята. Спасибо! Играйте в LOST ARK.

Условная заявка в Квике

А вы знаете, что Пушкин А.С. не знал, что такое условная заявка в Квике? А я знаю не только о ней. Он был писателем, он книжки, оказывается, писал. Не знаток типа Вассермана, который все знает, а писатель, честное слово. И у него нет ни одной статьи о биржевой торговле, а у меня есть.

Условная заявка пройдет!

В дополнение к статье о платных заявках, взорванном мозге и режиме т2 ,предлагаю статью об условной или стоп-заявке, так как она наиболее популярный и многообразный способ подачи торговых поручений в терминале. Чтобы вызвать форму подачи стоп-заявки нужно нажать на F6, нажать на правую кнопку мышки, наведя курсор на таблицу текущих параметров или выбрав соответствующий подпункт в пункте «Действия» горизонтального меню.

Стоп-заявка – это торговое поручение на исполнение сделки в случае наступления определенных условий, заданных Вами при создании этого поручения. Ее отличие от других видов ордеров в том, что она передается на биржу, только если условия ее исполнения выполнены и не снимается автоматически после завершения торгов в день ее создания, если она не исполнена.

В торговом терминале Квик в форме создания заявки можно выбрать ее вид — их пять: со связанной заявкой, стоп-лимит, стоп-цена по другой бумаге, тэйк-профит, тэйк-профит и стоп-лимит.

Условная заявка — две вещи по одной цене.

Остановимся отдельно на каждом из них.

Со связанной заявкой – это два поручения в одном, одновременное выставление двух заявок, одна из которых для оптимистического сценария, а другая для пессимистического. Если цена пойдет вверх,то сработает лимитированная, а если вниз, то стоп-заявка. Это все ради одного инструмента в одном его объеме, то есть, проще говоря, продаем тещу на рынке за сто, но если не прокатит, то уж лучше за 80, чем за 70 копеек. По исполнению одной из них, вторая автоматически снимется.

Стоп-лимит — поручение продать или купить нужный Вам инструмент по указанной Вами цене, в случае достижения ею указанного Вами уровня. То есть, если стоимость среднестатистической тещи на рынке снизилась до 70, предложить свою за 69 копеек.

Стоп-цена по другой бумаге – выставляется для подачи поручения на покупку или продажу актива в момент, когда цена другого актива достигнет определенного значения. То есть, если соседская теща будет стоить 50, продать свою за 20 копеек.

Тэйк-профит — это ордер на осуществление сделки при отклонении цены от максимального или минимального локального уровня на указанную Вами величину при достижении ею обозначенного Вами значения. Порядок его работы таков:

  1. Подается тэйк–профит ордер.
  2. Цена достигает указанного значения.
  3. Система определяет локальный максимум или минимум цены. (фиксирует его только на сегодняшний день)
  4. Начинается отслеживание котировок системой, с целью не пропустить момент,
    когда стоимость актива отступит от максимума или минимума на величину
    отступа, указанного в ордере.
  5. Стоимость изменилась на величину отступа.
  6. Подается лимитированная заявка на покупку или продажу по цене меньшей или большей цены-отступа на величину защитного спрэда. (термины из формы подачи в терминале Квик). Защитный спрэд предназначен для опережения графика котировок в случае быстрого изменения.

Тэйк–профит и стоп–лимит – это одновременное выставление двух этих заявок при работе с одним инструментом. Первая предназначена для оптимистического сценария (фиксация прибыли), а вторая для пессимистического (ограничение убытков). В случае исполнения одной из них, вторая снимается автоматически.

В этом абзаце нужно сделать вывод, подытожить информацию и оценить ее на пять с плюсом и вставить ссылку на статью про объединение, слияние, поглощение. Вывод такой: условная заявка в Квике – это хорошо! Удобная форма, красивая комбинация, приятный эффект – все для инвестора, для трейдера, для народа. Пользуйтесь на здоровье, но бойтесь потерять свои кровные денежки, вставляя не те циферки в форму. Не забудьте нажать кнопочку и считайте, что я сказал Вам: «Большое спасибо!»

Определение узких денег

Что такое узкие деньги?

Узкие деньги — это категория денежной массы, которая включает все физические деньги, такие как монеты и валюта, депозиты до востребования и другие ликвидные активы, находящиеся в распоряжении центрального банка.

В США узкие деньги классифицируются как M1 (M0 + счета до востребования). В Соединенном Королевстве самым узким средством измерения денег являются банкноты и монеты, находящиеся в обращении.

Ключевые выводы

  • Также известные как M0, узкие деньги относятся к физическим деньгам, таким как монеты и валюта, депозиты до востребования и другие ликвидные активы, которые легко доступны для центральных банков.
  • Узкие деньги — это подмножество широкой денежной массы, которая включает долгосрочные депозиты и другие депозитные счета.

Что такое узкие деньги

Название происходит от того факта, что M1 / ​​M0 являются наиболее узкими или наиболее ограничивающими формами денег, которые являются основой средства обмена в экономике. Эта категория денег считается наиболее доступной для транзакций и торговли.

Узкая денежная масса содержит только наиболее ликвидные финансовые активы.Эти средства должны быть доступны по запросу, что ограничивает категорию физическими банкнотами и монетами, а также средствами, хранящимися на наиболее доступных депозитных счетах. По данным Организации экономического сотрудничества и развития (ОЭСР), по состоянию на декабрь 2020 года Соединенные Штаты имеют самый большой в мире запас узких денег, за ними следуют Венгрия, Польша, Израиль и Новая Зеландия.

Как правило, наличие ликвидной денежной массы , будь то долгосрочная или краткосрочная , должно иметь прямое влияние на его экономическое здоровье.Однако изменения в экономике вкупе с изменениями в финансовой отрасли привели к разрыву этих прямых отношений. Федеральная резервная система не реализует свою политику через изменение денежной массы. Вместо этого он фокусируется на процентных ставках. Но он отслеживает изменения узкой и широкой денежной массы, чтобы сформулировать свой ответ на преобладающее состояние экономики.

Соответствующие счета

Наиболее доступные счета, такие как сберегательные и текущие депозитные счета, квалифицируются как узкие деньги.Средства на счетах считаются доступными по запросу, даже если для транзакции используются механизмы, отличные от физической валюты. Обычно сюда входят средства, уплаченные с использованием транзакций по дебетовой карте или различных чеков.

Узкие деньги и широкая денежная масса

В то время как M1 / ​​M0 используются для описания узких денег, M2 / M3 / M4 квалифицируются как широкие деньги, а M4 представляет собой самую крупную концепцию денежной массы. Широкая денежная масса может включать в себя различные депозитные счета, срок погашения которых может занять более 24 часов, и которые будут считаться доступными.Их часто называют долгосрочными срочными депозитами, потому что их деятельность ограничена определенными временными требованиями.

Узкие деньги и денежная масса

M1 / M0 — это только часть денежной массы. Денежная масса включает предметы всех категорий от M0 до M4. Следовательно, он представляет собой как наиболее ликвидные, так и менее ликвидные денежные средства и депозитные активы, хранящиеся в стране. Это включает средства в облигациях или других ценных бумагах, а также институциональные счета денежного рынка.

Для M4 самые широкие определения денежной массы и общий внешний предел для инвестиций, которые считаются частью денежной массы, — это те, срок погашения которых запланирован на пять лет или менее. Однако эта продолжительность не является строгим определением. Как и в случае всех уровней денежной массы, страны могут классифицировать свои средства по-разному. Например, исключение M0 или M4 в качестве меры и рассмотрение денежной массы, разделенной только на категории M1, M2 и M3.

Валюта, M1 и M2 — Принципы экономики

Цели обучения

К концу этого раздела вы сможете:

  • Противопоставление денежной массы M1 и денежной массы M2
  • Классифицировать деньги как денежную массу M1 или денежную массу M2

Наличные деньги в кармане, безусловно, служат деньгами.Но как насчет чеков или кредитных карт? Они тоже деньги? Вместо того чтобы пытаться сформулировать единственный способ измерения денег, экономисты предлагают более широкие определения денег, основанные на ликвидности. Ликвидность означает, насколько быстро финансовый актив может быть использован для покупки товара или услуги. Например, наличные очень ликвидны. На ваш счет в 10 долларов можно легко купить гамбургер в обеденное время. Однако 10 долларов, которые есть на вашем сберегательном счете, не так-то просто использовать. Вы должны пойти в банк или банкомат и снять наличные, чтобы купить обед.Таким образом, 10 долларов на вашем сберегательном счете — это
минус ликвидных.

Федеральный резервный банк , который является центральным банком США, является банковским регулятором, отвечает за денежно-кредитную политику и определяет деньги в соответствии с их ликвидностью. Есть два определения денег: денежная масса M1 и M2. Денежная масса M1 включает очень ликвидные деньги, такие как наличные деньги, чеки (до востребования) и дорожные чеки. Денежная масса M2 менее ликвидна по своей природе и включает M1 плюс сбережения и срочные вклады, депозитные сертификаты и деньги рыночные фонды.

Денежная масса M1 включает монет и валюты в обращении — монеты и банкноты, которые находятся в обращении в экономике и не хранятся в Казначействе США, в Федеральном резервном банке или в банковских хранилищах. С валютой тесно связаны чековые депозиты, также известные как депозиты до востребования . Это суммы, хранящиеся на текущих счетах. Они называются депозитами до востребования или чековыми депозитами, потому что банковское учреждение должно отдавать вкладчику его деньги «по требованию», когда выписывается чек или используется дебетовая карта.Эти элементы вместе — валюта и текущие счета в банках — составляют определение денег, известное как M1, которое ежедневно измеряется Федеральной резервной системой. Дорожные чеки также включены в M1, но их использование за последнее время сократилось.

Более широкое определение денег, M2 включает в себя все, что есть в M1, но также добавляет другие типы депозитов. Например, M2 включает сберегательных вкладов в банках, которые представляют собой банковские счета, на которые вы не можете выписать чек напрямую, но с которых вы можете легко снять деньги в банкомате или в банке.Многие банки и другие финансовые учреждения также предлагают возможность инвестировать в фондов денежного рынка , где депозиты многих индивидуальных инвесторов объединяются и инвестируются безопасным способом, например, в краткосрочные государственные облигации. Еще одним ингредиентом M2 являются относительно небольшие (то есть менее 100000 долларов) депозитных сертификатов (CD) или срочных вкладов , которые представляют собой счета, которые вкладчик обязался оставить в банке на определенный период времени. от нескольких месяцев до нескольких лет в обмен на более высокую процентную ставку.Короче говоря, все эти типы M2 — это деньги, которые вы можете снимать и тратить, но для этого требуется больше усилий, чем элементы на рис. 1 M1, которые должны помочь в визуализации взаимосвязи между M1 и M2. Обратите внимание, что M1 включен в расчет M2.

Рисунок 1. Связь между деньгами M1 и M2. У денег М1 и М2 есть несколько определений, от узкого до широкого. M1 = монеты и валюта в обращении + чековый депозит (до востребования) + дорожные чеки. M2 = M1 + сберегательные вклады + фонды денежного рынка + депозитные сертификаты + другие срочные вклады.

Федеральная резервная система отвечает за отслеживание сумм M1 и M2 и готовит еженедельный выпуск информации о денежной массе. Чтобы дать представление о том, как выглядят эти суммы, согласно оценке денежной массы США Федеральным резервным банком, в конце февраля 2015 года M1 в Соединенных Штатах составлял 3 триллиона долларов, а M2 — 11,8 триллиона долларов. Распределение части каждого типа денег, которые включали M1 и M2 в феврале 2015 года, предоставленные Федеральным резервным банком, представлены в таблице 1.

Компоненты M1 в США (февраль 2015 г., с учетом сезонных колебаний) миллиарды долларов
Валюта $ 1 271,8
Дорожные чеки $ 2,9
Вклады до востребования и другие текущие счета $ 1 713,5
Всего M1 2 988,2 долл. США (или 3 трлн долл. США)
Компоненты M2 в U.S. (февраль 2015 г., с учетом сезонных колебаний) миллиарды долларов
Денежная масса M1 2 988,2 долл. США
Сберегательные счета $ 7 712,1
Срочные вклады $ 509,2
Индивидуальные остатки паевых инвестиционных фондов денежного рынка $ 610,8
Всего M2 11 820,3 долл. США (или 11,8 трлн долл. США)
Таблица 1. M1 и M2 Статистический выпуск Федеральной резервной системы, показатели денежной массы (Источник: Статистический выпуск Федеральной резервной системы, http://www.federalreserve.gov/RELEASES/h6/current/default.htm#t2tg1link)

Линии, разделяющие M1 и M2, могут стать немного размытыми. Иногда элементы M1 не рассматриваются одинаково; например, некоторые компании не принимают личные чеки на крупные суммы, но принимают дорожные чеки или наличные. Изменения в банковской практике и технологиях сделали сберегательные счета в M2 более похожими на текущие счета в M1.Например, некоторые сберегательные счета позволяют вкладчикам выписывать чеки, использовать банкоматы и оплачивать счета через Интернет, что упростило доступ к сберегательным счетам. Как и в случае со многими другими экономическими терминами и статистикой, важно знать сильные и слабые стороны различных определений денег, а не полагать, что такие определения столь же ясны для экономистов, как, скажем, определение азота для химиков. .

Где в эту картину вписываются «пластиковые деньги», такие как дебетовые карты, кредитные карты и смарт-деньги? Дебетовая карта , как и чек, является инструкцией банку пользователя о переводе денег напрямую и немедленно с вашего банковского счета продавцу.Важно отметить, что в нашем определении денег это чековых депозита, являются деньгами, а не бумажный чек или дебетовая карта. Хотя вы можете совершить покупку с помощью кредитной карты , это не считается деньгами, а скорее является краткосрочной ссудой, предоставленной вам компанией-эмитентом кредитной карты. Когда вы совершаете покупку с помощью кредитной карты, компания-эмитент кредитной карты немедленно переводит деньги со своего текущего счета продавцу, а в конце месяца компания-эмитент кредитной карты отправляет вам счет на сумму, которую вы сняли в этом месяце.Пока вы не оплатите счет по кредитной карте, вы фактически заняли деньги у компании-эмитента кредитной карты. С помощью смарт-карты вы можете хранить на карте определенную сумму денег, а затем использовать ее для покупок. Некоторые «смарт-карты», используемые для определенных целей, таких как междугородные телефонные звонки или совершение покупок в книжном магазине или кафетерии кампуса, на самом деле не так уж и умны, потому что их можно использовать только для определенных покупок или в определенных местах.

Короче говоря, кредитные карты, дебетовые карты и смарт-карты — это разные способы перевода денег при совершении покупки.Но наличие большего количества кредитных или дебетовых карт не меняет количества денег в экономике, равно как и большее количество напечатанных чеков не увеличивает количество денег на вашем текущем счете.

Одно из ключевых посланий, лежащих в основе обсуждения M1 и M2, заключается в том, что деньги в современной экономике — это не просто бумажные купюры и монеты; вместо этого деньги тесно связаны с банковскими счетами. Действительно, макроэкономическая политика в отношении денег в основном проводится через банковскую систему .В следующем разделе объясняется, как функционируют банки и как банковская система страны может создавать деньги.

Прочтите краткую статью о текущих проблемах денежно-кредитной политики в Швеции.


Деньги измеряются несколькими определениями: M1 включает валюту и деньги на текущих счетах (депозиты до востребования). Дорожные чеки также являются компонентом M1, но их использование сокращается. M2 включает все M1, а также сберегательные вклады, срочные вклады, такие как депозитные сертификаты, и фонды денежного рынка.

Вопросы для самопроверки

  1. Если вы ходите по магазинам в поисках одежды и книг, что вам проще и удобнее всего потратить: M1 или M2? Поясните свой ответ.
  2. Для следующего списка элементов укажите, находятся ли они в M1, M2 или ни в одном из них:
    1. Ваша кредитная линия в размере 5000 долларов США по карте Bank of America
    2. Дорожные чеки на сумму 50 долларов, которые вы еще не использовали
    3. 1 доллар в четвертаках в кармане
    4. 1200 долларов на текущий счет
    5. $ 2000 у вас на счете денежного рынка

Обзорные вопросы

  1. Какие компоненты денег считаются частью M1?
  2. Какие составляющие денег учитываются в М2?

Вопросы о критическом мышлении

  1. Объясните, почему вы думаете, что Федеральный резервный банк отслеживает M1 и M2.
  2. Общее количество валюты США в обращении, разделенное на население США, составляет около 3500 долларов на человека. Это больше, чем у большинства из нас есть. Где все деньги?
  3. Если вы возьмете 100 долларов из своей копилки и положите их на свой текущий счет, как изменится M1? Изменился ли M2?

Статистический выпуск Федеральной резервной системы. 23 ноября 2013 г. http://www.federalreserve.gov/RELEASES/h6/current/default.htm#t2tg1link.

Глоссарий

монеты и денежные средства в обращении
монеты и банкноты, которые циркулируют в экономике и не принадлежат Соединенному Королевству.Казначейство S, в Федеральном резервном банке или в банковских хранилищах
кредитная карта
немедленно переводит деньги с текущего счета компании-эмитента кредитной карты продавцу, и в конце месяца пользователь должен деньги компании-эмитенту кредитной карты; кредитная карта краткосрочная ссуда
дебетовая карта
, как и чек, представляет собой инструкцию банку пользователя перевести деньги напрямую и немедленно с вашего банковского счета продавцу.
вклад до востребования
чековый депозит в банках, который можно получить, сняв наличные или выписав чек
Денежная масса M1
— узкое определение денежной массы, которое включает валюту и текущие счета в банках и, в меньшей степени, дорожные чеки.
Денежная масса M2
определение денежной массы, которое включает все в M1, но также добавляет сберегательные вклады, фонды денежного рынка и депозитные сертификаты
Фонд денежного рынка
депозиты многих инвесторов объединяются и инвестируются безопасным способом, как краткосрочные государственные облигации
сберегательный вклад
банковский счет, на котором вы не можете снять деньги, выписав чек, но можете снять деньги в банке или легко перевести их на текущий счет
смарт-карта
сохраняет определенную стоимость денег на карте, а затем карту можно использовать для покупок
срочный вклад
счет, который вкладчик обязался оставить в банке на определенный период времени в обмен на более высокую процентную ставку; также называется депозитным сертификатом

Решения

Ответы на вопросы самопроверки

  1. Валюту и чеки в M1 потратить проще всего.Труднее потратить M2 напрямую, хотя, если в торговом центре есть банкомат, вы можете довольно быстро превратить M2 со своего сберегательного счета в M1 валюты. Если ваш ответ о «кредитных картах», то вы действительно говорите о расходах M1, хотя это M1 со счета компании, выпускающей кредитные карты, которую вы будете погашать позже, когда придет срок оплаты счета по кредитной карте.
    1. Ни в M1, ни в M2
    2. Это часть M1, и поскольку M2 включает M1, он также является частью M2
    3. Валюта, находящаяся в государственных руках, является частью M1 и M2
    4. Проверка депозитов в M1 и M2
    5. Счета денежного рынка в М2

Чтение: Измерение денег: валюта, M1 и M2

Наличные деньги в кармане, безусловно, служат деньгами.Но как насчет чеков или кредитных карт? Они тоже деньги? Вместо того чтобы пытаться сформулировать единственный способ измерения денег, экономисты предлагают более широкие определения денег, основанные на ликвидности. Ликвидность означает, насколько быстро финансовый актив может быть использован для покупки товара или услуги. Например, наличные очень ликвидны. На ваш счет в 10 долларов можно легко купить гамбургер в обеденное время. Однако 10 долларов, которые есть на вашем сберегательном счете, не так-то просто использовать. Вы должны пойти в банк или банкомат и снять наличные, чтобы купить обед.Таким образом, 10 долларов на вашем сберегательном счете — это минус ликвидных средств.

Федеральный резервный банк , являющийся центральным банком Соединенных Штатов, является банковским регулятором, отвечает за денежно-кредитную политику и определяет деньги в соответствии с их ликвидностью. Мы обсудим это позже в модуле, а пока есть два определения денег: денежная масса M1 и M2. Денежная масса M1 включает очень ликвидные деньги, такие как наличные деньги, чеки (вклады до востребования) и дорожные чеки. Денежная масса M2 менее ликвидна по своей природе и включает M1 плюс сбережения и срочные вклады, депозитные сертификаты и фонды денежного рынка.

M1

Денежная масса M1 включает монеты и денежные единицы в обращении — монеты и банкноты, которые находятся в обращении в экономике и не хранятся в Казначействе США, в Федеральном резервном банке или в банковских хранилищах. С валютой тесно связаны чековые депозиты, также известные как депозиты до востребования . Это суммы, хранящиеся на текущих счетах.Они называются депозитами до востребования или чековыми депозитами, потому что банковское учреждение должно отдавать вкладчику его деньги «по требованию», когда выписывается чек или используется дебетовая карта. Эти элементы вместе — валюта и текущие счета в банках — составляют определение денег, известное как M1, которое ежедневно измеряется Федеральной резервной системой. Дорожные чеки также включены в M1, но их использование за последнее время сократилось.

M2

Более широкое определение денег, M2 включает в себя все, что есть в M1, но также добавляет другие типы депозитов.Например, M2 включает сберегательных вкладов в банках, которые представляют собой банковские счета, на которые вы не можете выписать чек напрямую, но с которых вы можете легко снять деньги в банкомате или в банке. Многие банки и другие финансовые учреждения также предлагают возможность инвестировать в фонды денежного рынка , где депозиты многих индивидуальных инвесторов объединяются и инвестируются безопасным способом, например, в краткосрочные государственные облигации. Еще одним ингредиентом M2 являются относительно небольшие (то есть менее 100000 долларов) депозитных сертификатов (CD) или срочных вкладов , которые представляют собой счета, которые вкладчик обязался оставить в банке на определенный период времени. от нескольких месяцев до нескольких лет в обмен на более высокую процентную ставку.Короче говоря, все эти типы M2 — это деньги, которые вы можете снимать и тратить, но для этого требуется больше усилий, чем для предметов в M1. Рисунок 13.3 должен помочь визуализировать взаимосвязь между M1 и M2. Обратите внимание, что M1 включен в расчет M2.

Федеральная резервная система отвечает за отслеживание сумм M1 и M2 и готовит еженедельный выпуск информации о денежной массе. Чтобы дать представление о том, на что похожи эти суммы, согласно оценке Федерального резервного банка США.S. денежная масса, на конец 2012 года M1 в Соединенных Штатах составляла 2,4 триллиона долларов, а M2 — 10,4 триллиона долларов. Для сравнения, размер ВВП США в 2012 году составил 16,3 трлн долларов. Распределение части каждого типа денег, которые включали M1 и M2 в 2012 году, предоставленные Федеральным резервным банком, представлены в таблице 13.1.

Таблица 13.1. M1 и M2 Статистический выпуск Федеральной резервной системы, показатели денежной массы

Компоненты M1 в США в 2012 г. миллиарды долларов
Валюта 1 090 долларов.0
Дорожные чеки $ 3,8
Вклады до востребования и другие текущие счета $ 1 351,1
Всего M1 2444,9 долл. США (или 2,4 трлн долл. США)
Компоненты M2 в США в 2012 г. миллиарды долларов
Денежная масса M1 2444 доллара.9
Сберегательные счета $ 6 692,0
Срочные вклады 631,0 $
Индивидуальные остатки паевых инвестиционных фондов денежного рынка $ 640,1
Всего M2 10 408,7 млрд долларов (или 10,4 трлн долларов)
(Источник: Статистический выпуск Федеральной резервной системы, http://www.federalreserve.gov/RELEASES/h6/current/default.htm # t2tg1link)

Линии, разделяющие M1 и M2, могут стать немного размытыми. Иногда элементы M1 не рассматриваются одинаково; например, некоторые компании не принимают личные чеки на крупные суммы, но принимают дорожные чеки или наличные. Изменения в банковской практике и технологиях сделали сберегательные счета в M2 более похожими на текущие счета в M1. Например, некоторые сберегательные счета позволяют вкладчикам выписывать чеки, использовать банкоматы и оплачивать счета через Интернет, что упростило доступ к сберегательным счетам.Как и в случае со многими другими экономическими терминами и статистикой, важно знать сильные и слабые стороны различных определений денег, а не полагать, что такие определения столь же ясны для экономистов, как, скажем, определение азота для химиков. .

Прочие деньги

Где в эту картину вписываются «пластиковые деньги», такие как дебетовые карты, кредитные карты и смарт-деньги? Дебетовая карта , как и чек, является инструкцией банку пользователя о переводе денег напрямую и немедленно с вашего банковского счета продавцу.Важно отметить, что в нашем определении денег это чековых депозита, являются деньгами, а не бумажный чек или дебетовая карта. Хотя вы можете совершить покупку с помощью кредитной карты , это не считается деньгами, а скорее является краткосрочной ссудой, предоставленной вам компанией-эмитентом кредитной карты. Когда вы совершаете покупку с помощью кредитной карты, компания-эмитент кредитной карты немедленно переводит деньги со своего текущего счета продавцу, а в конце месяца компания-эмитент кредитной карты отправляет вам счет на сумму, которую вы сняли в этом месяце.Пока вы не оплатите счет по кредитной карте, вы фактически заняли деньги у компании-эмитента кредитной карты. С помощью смарт-карты вы можете хранить на карте определенную сумму денег, а затем использовать ее для совершения покупок. Некоторые «смарт-карты», используемые для определенных целей, таких как междугородные телефонные звонки или совершение покупок в книжном магазине или кафетерии кампуса, на самом деле не так уж и умны, потому что их можно использовать только для определенных покупок или в определенных местах.

Короче говоря, кредитные карты, дебетовые карты и смарт-карты — это разные способы перевода денег при совершении покупки.Но наличие большего количества кредитных или дебетовых карт не меняет количества денег в экономике, равно как и большее количество напечатанных чеков не увеличивает количество денег на вашем текущем счете.

Одно из ключевых посланий, лежащих в основе обсуждения M1 и M2, заключается в том, что деньги в современной экономике — это не просто бумажные купюры и монеты; вместо этого деньги тесно связаны с банковскими счетами. Действительно, макроэкономическая политика в отношении денег в основном проводится через банковскую систему .

ПОДКЛЮЧИТЬ ЭТО

Прочтите краткую статью о текущих проблемах денежно-кредитной политики в Швеции.

Измерение денег: валюта, M1 и M2

Цели обучения

  • Сопоставьте и классифицируйте деньги как денежную массу M1 и денежную массу M2

Измерение денег: валюта, M1 и M2

Мы определили деньги как все, что принято в качестве средства платежа, является средством сохранения стоимости, может использоваться как расчетная единица или стандарт отсрочки платежа.Что именно входит?

Наличные деньги в кармане, безусловно, служат деньгами. Но как насчет чеков или кредитных карт? Они тоже деньги? Вместо того чтобы пытаться сформулировать единственный способ измерения денег, экономисты предлагают более широкие определения денег, основанные на концепции ликвидности. Ликвидность означает, насколько быстро актив может быть использован для покупки товара или услуги. Ликвидность — понятие относительное. Например, наличные очень ликвидны. На ваш счет в 10 долларов можно легко купить гамбургер в обеденное время.Однако 10 долларов, которые есть на вашем сберегательном счете, не так-то просто использовать. Вы должны пойти в банк или банкомат и снять наличные, чтобы купить обед. Таким образом, 10 долларов на вашем сберегательном счете — это минус ликвидных средств. Акции и облигации еще менее ликвидны, поскольку их необходимо продать, чтобы преобразовать в платежные средства, и при этом они могут потерять в стоимости.

Экономисты обычно используют два определения денежной массы: M1 и M2. M1 включает наиболее ликвидные активы, такие как наличные деньги, чековые вклады (до востребования) и дорожные чеки. M2 включает M1 плюс некоторые менее ликвидные (но все же достаточно ликвидные) активы, включая сбережения и срочные вклады, депозитные сертификаты и фонды денежного рынка. Давайте рассмотрим эти два определения денег более подробно.

M1

M1 — наиболее узкое определение денежной массы. Он включает в себя монет и валюты в обращении — другими словами, они не хранятся в Казначействе США или Федеральном резервном банке, но находятся в обращении в экономике.

Тесно связаны с валютой чековые депозиты, также известные как депозиты до востребования .Это суммы, хранящиеся на текущих счетах. Они называются депозитами до востребования или чековыми депозитами, потому что банковское учреждение должно отдавать вкладчику его деньги «по требованию», когда выписывается чек или используется дебетовая карта. Эти элементы вместе — валюта и текущие счета в банках — составляют большую часть M1. Дорожные чеки также включены в M1, но их использование за последнее время сократилось.

M2

Более широкое определение денег, M2 включает в себя все, что есть в M1, но также добавляет другие типы депозитов.Например, M2 включает сберегательных вкладов в банках, которые представляют собой банковские счета, на которые вы не можете выписать чек напрямую, но с которых вы можете легко снять деньги в банкомате или в банке. Многие банки и другие финансовые учреждения также предлагают возможность инвестировать в фондов денежного рынка , где депозиты многих индивидуальных инвесторов объединяются и инвестируются безопасным способом, например, в краткосрочные государственные облигации. Еще одним ингредиентом M2 является мелкий номинал (то есть менее примерно 100000 долларов) депозитных сертификатов (CD) или срочных вкладов , которые представляют собой счета, которые вкладчик обязался оставить в банке на определенный период времени, от нескольких месяцев до нескольких лет в обмен на более высокую процентную ставку.Короче говоря, все эти типы M2 — это деньги, которые вы можете снимать и тратить, но для этого требуется больше усилий, чем для предметов в M1. Рисунок 1 должен помочь визуализировать отношения между M1 и M2. Обратите внимание, что M1 включен в расчет M2.

Рисунок 1. Связь между деньгами M1 и M2. Деньги M1 и M2 — два наиболее часто используемых определения денег. M1 = монеты и валюта в обращении + чековый депозит (до востребования) + дорожные чеки.M2 = M1 + сберегательные вклады + фонды денежного рынка + депозитные сертификаты + другие срочные вклады.

Федеральная резервная система отвечает за отслеживание сумм M1 и M2 и готовит еженедельный выпуск информации о денежной массе. В конце февраля 2015 года M1 в США составлял 3 триллиона долларов, а M2 — 11,8 триллиона долларов. В таблице 1 представлена ​​разбивка по части каждого типа денег, которые включали M1 и M2 в феврале 2015 года, как это было предоставлено Федеральным резервным банком.

Таблица 1. Статистические данные Федеральной резервной системы M1 и M2, показатели денежной массы (Источник: Статистические данные Федеральной резервной системы, http://www.federalreserve.gov/RELEASES/h6/current/default.htm#t2tg1link)
Компоненты M1 в США (февраль 2015 г., с учетом сезонных колебаний) миллиарды долларов
Валюта $ 1 271,8
Дорожные чеки $ 2,9
Вклады до востребования и другие текущие счета 1 713 долл. США.5
Всего M1 2 988,2 долл. США (или 3 трлн долл. США)
Компоненты M2 в США (февраль 2015 г., с учетом сезонных колебаний) миллиарды долларов
Денежная масса M1 2 988,2 долл. США
Сберегательные счета $ 7 712,1
Срочные вклады $ 509,2
Индивидуальные остатки паевых инвестиционных фондов денежного рынка 610 долларов.8
Всего M2 11 820,3 долл. США (или 11,8 трлн долл. США)

Линии, разделяющие M1 и M2, могут стать немного размытыми. Иногда элементы M1 не рассматриваются одинаково; например, некоторые компании не принимают личные чеки на крупные суммы, но принимают дорожные чеки или наличные. Изменения в банковской практике и технологиях сделали сберегательные счета в M2 более похожими на текущие счета в M1.Например, некоторые сберегательные счета позволяют вкладчикам выписывать чеки, использовать банкоматы и оплачивать счета через Интернет, что упростило доступ к сберегательным счетам. Как и в случае со многими другими экономическими терминами и статистикой, важно знать сильные и слабые стороны различных определений денег, а не полагать, что такие определения столь же ясны для экономистов, как, скажем, определение азота для химиков. .

Прочие деньги

Где в эту картину вписываются «пластиковые деньги», такие как дебетовые карты, кредитные карты и смарт-деньги? Дебетовая карта , как и чек , — ​​это инструкция банку пользователя о немедленном переводе денег с вашего банковского счета продавцу.Таким образом, дебетовая карта — это столько же денег, сколько и чек. Важно отметить, что в нашем определении денег это чековых депозита, являются деньгами, а не бумажный чек или дебетовая карта. Хотя вы можете совершить покупку с помощью кредитной карты , это не считается деньгами, а скорее является краткосрочной ссудой, предоставленной вам компанией-эмитентом кредитной карты. Когда вы совершаете покупку с помощью кредитной карты, компания-эмитент кредитной карты немедленно переводит деньги со своего текущего счета продавцу, а в конце месяца компания-эмитент кредитной карты отправляет вам счет на сумму, которую вы сняли в этом месяце.Пока вы не оплатите счет по кредитной карте, вы фактически заняли деньги у компании-эмитента кредитной карты. С помощью смарт-карты вы можете хранить на карте определенную сумму денег, а затем использовать ее для покупок. Некоторые «смарт-карты», используемые для определенных целей, таких как междугородные телефонные звонки или совершение покупок в книжном магазине или кафетерии кампуса, на самом деле не так уж и умны, потому что их можно использовать только для определенных покупок или в определенных местах.

Короче говоря, кредитные карты, дебетовые карты и смарт-карты — это разные способы перевода денег при совершении покупки.Но наличие большего количества кредитных или дебетовых карт не меняет количества денег в экономике, равно как и большее количество напечатанных чеков не увеличивает количество денег на вашем текущем счете.

Одно из ключевых посланий, лежащих в основе обсуждения M1 и M2, заключается в том, что деньги в современной экономике — это не просто бумажные купюры и монеты; вместо этого деньги тесно связаны с банковскими счетами. Действительно, макроэкономическая политика в отношении денег в основном проводится через банковскую систему.

Попробуй

Эти вопросы позволят вам получить столько практики, сколько вам нужно, поскольку вы можете щелкнуть ссылку вверху первого вопроса («Попробуйте другую версию этих вопросов»), чтобы получить новый набор вопросов.Практикуйтесь, пока не почувствуете себя комфортно, задавая вопросы.

Глоссарий

монет и денежных знаков в обращении:
монеты и банкноты, которые находятся в обращении в экономике и не хранятся в Казначействе США, в Федеральном резервном банке или в банковских хранилищах
кредитная карта:
немедленно переводит деньги с текущего счета компании-эмитента кредитной карты продавцу, и в конце месяца пользователь должен деньги компании-эмитенту кредитной карты; кредитная карта краткосрочная ссуда
дебетовая карта:
, как и чек, представляет собой инструкцию банку пользователя перевести деньги напрямую и немедленно с вашего банковского счета продавцу.
депозит до востребования:
чековый депозит в банках, который можно получить, сняв наличные или выписав чек
ликвидность:
как быстро и легко можно преобразовать актив в платежное средство для совершения покупки
Денежная масса M1:
— узкое определение денежной массы, которое включает валюту и текущие счета в банках и, в меньшей степени, дорожные чеки.
Денежная масса M2:
определение денежной массы, которое включает все в M1, но также добавляет сберегательные вклады, фонды денежного рынка и депозитные сертификаты
фонд денежного рынка:
депозиты многих инвесторов объединяются и инвестируются безопасным способом, как краткосрочные государственные облигации
сберегательный депозит:
банковский счет, на котором вы не можете снять деньги, выписав чек, но можете снять деньги в банке или легко перевести их на текущий счет
смарт-карта:
сохраняет определенную стоимость денег на карте, после чего можно использовать карту для покупок
срочный вклад:
счет, который вкладчик обязался оставить в банке на определенный период времени в обмен на более высокую процентную ставку; также называется депозитным сертификатом

Внесите свой вклад!

У вас была идея улучшить этот контент? Нам очень понравится ваш вклад.

Улучшить эту страницуПодробнее

Так что же такое денежная масса?

Деньги — штука странная. У него есть неуловимые свойства, которых, похоже, нет ни у одной другой вещи из нашего опыта. Если у меня есть счет на 100 долларов, у меня есть немного денег. Если я отдам его в банк, у меня будут деньги в банке, но деньги также есть в банке. Деньги просто удвоились? Мы знаем, что с точки зрения бухгалтерского учета этого не произошло, потому что деньги банка компенсируются обязательством (они должны мне 100 долларов), но это не меняет того факта, что банк физически имеет счет, а у меня 100 долларов на депозит.Это возвращает нас к вопросу: как мы определяем «деньги»?

Правительство определяет денежную массу как матрицу из нескольких определений. Вы видите их в деловом разделе утренней газеты с такими обозначениями, как «M0», «M1» и «M2». Но что это? Вот на что мы постараемся ответить. Итак, согласно одному определению денег, наша 100-долларовая банкнота является единственными «Деньгами», участвующими в вышеупомянутом обсуждении, но согласно другому определению она умножается на 200 долларов (100 долларов, которые у нас есть на депозите, и еще 100 долларов, лежащих в ящике кассира). .

Начнем с определений, а затем объясним на примерах.

Определения агрегатов денежной массы (Федеральная резервная система США):

  • M0 = Общая сумма всей физической валюты, включая монеты.
  • MB = M0 + деньги, которые Федеральные резервные банки хранят на депозитах в Федеральной резервной системе.
  • M1 = M0 — наличные деньги в банковских хранилищах + существующие дорожные чеки и деньги на депозите на текущих счетах (это ликвидные деньги в обращении)
  • M2 = M1 + обычные сберегательные счета, счета денежного рынка, паевые инвестиционные фонды денежного рынка и депозитные сертификаты на сумму менее 100 000 долларов.
  • MZM = M2 — срочные вклады (они называются деньгами с нулевым сроком погашения и представляют собой все деньги, которые могут быть обналичены и использованы «сегодня»).
  • M3 = M2 + депозитные сертификаты на сумму более 100 000 долларов США, депозиты в евродолларах и соглашения о обратной покупке.
  • M4- = M3 + Коммерческая бумага
  • M4 = M3 + Коммерческие ценные бумаги и казначейские векселя
  • L = M4 + Банковские акцепты
class = «мягкие стороны — 12рем алегрея — рег»>

Примеры:

  • Uncle Moneybags (имя тщательно выбрано, чтобы избежать нарушения прав на товарный знак) имеет 500 долларов наличными (2 банкноты по 100 долларов, 2 банкноты по 50 долларов, 6 банкнот по 20 долларов, 5 банкнот по 10 долларов, 5 банкнот по 5 долларов и 5 банкнот по 1 доллару).В дополнение к этим 500 долларам у него было две купюры на 500 долларов на общую сумму 1500 долларов, но федеральный резерв прекратил печатать купюры на 500 долларов, и дядя Манибэгс подарил их музею. Агрегаты денежной массы, представленные денежными средствами дяди Мешка, следующие: MB = 500 долларов, M0 = 500 долларов, M1 = 500 долларов, M2 = 500 долларов.
  • Скотти Дог съедает одну из 100-долларовых банкнот дяди Мешкача. (MB = 400 долларов США, M0 = 400 долларов США, M1 = 400 долларов США, M2 = 400 долларов США)
  • Дядя Манибэгс кладет оставшиеся 400 долларов на свой текущий счет, чтобы защитить его от собаки, поедающей деньги.(MB = 400 долларов США, M0 = 0 долларов США, M1 = 400 долларов США, M2 = 400 долларов США)
  • Банк держит 10% своих денежных средств в резерве, а оставшиеся 90% ссужает водителю гоночного автомобиля, создавая новый M1 на 360 долларов. (MB = 400 долларов, M0 = 360 долларов, M1 = 760 долларов, M2 = 760 долларов) Другими словами, наличными по-прежнему остается всего 400 долларов, но у дяди Манибэгса есть 400 долларов в банке, у гонщика 360 долларов наличными, а в банке имеет остальные 40 долларов (которые учитываются в МБ, но не в M0).
  • Гонщик кладет свои 360 долларов в другой банк (MB = 400 долларов, M0 = 0 долларов, M1 = 760 долларов, M2 = 760 долларов)
  • Второй банк держит 10% резервов и ссужает пахарю 324 доллара.(MB = 400 долларов США, M0 = 324 доллара США, M1 = 1084 доллара США, M2 = 1084 доллара США.) Обратите внимание, что выдача депозитов приводит к тому, что денежная масса вырастает намного больше, чем фактическая сумма наличной валюты, но требования, чтобы банки держали некоторую валюту Резерв действительно ставит предел этому росту.
  • Наконец, дядя Денежный мешок выписывает чек на 300 долларов в наличные и переводит этот чек на счет денежного рынка. Этот аккаунт является частью M2, но не частью M1. (MB = 400 долларов США, M0 = 324 доллара США, M1 = 784 доллара США, M2 = 1084 доллара США)
class = «мягкие стороны — 12рем алегрея — рег»>

Отвечая на вопрос, что такое деньги, мы можем заключить, что у нас есть разные меры денег в зависимости от того, насколько широкое определение мы используем.В конце нашего примера имеется 400 долларов наличных денег, но только 324 доллара в обращении. Общая сумма денег в обращении или на депозите в банках составляет 1084 доллара, но только 784 доллара из них являются полностью ликвидными (поскольку за обналичивание счета денежного рынка может взиматься штраф). Надеюсь, теперь, когда вы видите эти цифры на первой странице бизнес-раздела, они будут иметь какое-то значение.

Скажите «Привет» дяде Мешковцу в следующий раз, когда будете в Атлантик-Сити.

Ангиогенная способность M1- и M2-поляризованных макрофагов определяется уровнями TIMP-1 в комплексе с их секретируемым proMMP-9 | Кровь

Установлена ​​сильная связь между инфильтрацией лейкоцитов и различными патофизиологическими состояниями, включающими ремоделирование и трансформацию тканей. 1-3 Лейкоцитарный инфильтрат может быть представлен кроветворными клетками различных линий, включая лимфоциты, гранулоциты и макрофаги. Связанные с опухолью макрофаги (ТАМ) участвуют в прогрессировании рака, 4,5 и большое количество ТАМ связаны с плохим прогнозом при некоторых злокачественных новообразованиях человека. 6,7 Замечательная пластичность макрофагов позволяет им приобретать функционально различные фенотипы. 8,9 Два основных альтернативных фенотипа, а именно M1 и M2, были приписаны ТАМ, подавляющим и способствующим опухолям, соответственно, хотя спектр состояний активации был продемонстрирован в нескольких условиях. 10-13 В общем, макрофаги M1 связаны с индукцией сильного иммунного ответа и противоопухолевой активности. Напротив, макрофаги M2, по-видимому, подавляют иммунный надзор и усиливают неоваскуляризацию.

Макрофаг-индуцированный ангиогенез включает ангиогенный переключатель, 14,15 , который запускается протеолитическим высвобождением ангиогенных факторов роста прямого действия активированным зимогеном матриксной металлопротеиназы-9 (proMMP-9), поставляемым инфильтрирующими макрофагами. 16,17 У хозяев Mmp9 -null отсутствие экспрессии proMMP-9 предотвращает ангиогенное переключение и значительно снижает ангиогенез и метастазирование. 16,18 Точно так же биохимическое ингибирование общей активности ММП-9 также серьезно снижает уровни ангиогенеза. 17 Однако и ангиогенное переключение, и последующий ангиогенез не всегда приписываются макрофагам и продуцируемым макрофагами proMMP-9. Исследования показали, что запускающий ангиогенез proMMP-9 может продуцироваться различными воспалительными типами лейкоцитов, часто представленными гранулоцитами. 19-23

Накопленные данные демонстрируют, что среди гранулоцитарных лейкоцитов нейтрофилы составляют критический тип миелоидных клеток, доставляющих индуцирующий ангиогенез proMMP-9. 24-30 Высокий ангиогенный потенциал нейтрофила proMMP-9 был связан с его уникальным тканевым ингибитором отсутствия металлопротеиназы (TIMP). 31 Поскольку нейтрофилы не экспрессируют TIMP-1, естественный ингибитор фермента MMP-9 и отрицательный регулятор активации proMMP-9, 32 нейтрофилов proMMP-9 высвобождается без ограничения TIMP-1. 33 Таким образом, нейтрофил proMMP-9, не содержащий ТИМП, может быстро активироваться в тканевом микроокружении и протеолитически высвобождать секвестрированные матриксом ангиогенные факторы, такие как фактор роста эндотелия сосудов и фактор роста фибробластов (FGF) -2. 34

Возможная доставка MMP-9 также была связана с M2-искаженными TAM, которые, как было показано, экспрессируют повышенные уровни proMMP-9 по сравнению с другими подмножествами макрофагов. 35-38 Однако, хотя васкуляризация опухоли была связана с присутствием M2-подобных ТАМ, 38-40 не было представлено доказательств, однозначно доказывающих, что способность М2-поляризованных макрофагов индуцировать ангиогенез зависела от продукции ими MMP- 9. Этот недостаток прямых экспериментальных доказательств проангиогенных функций MMP-9, секретируемых макрофагами M2, послужил толчком к настоящему сравнительному и количественному исследованию способности индуцировать ангиогенез макрофагов человека и мыши и их секретируемого proMMP-9.

Здесь мы исследовали способность человеческих моноцитов, полученных из моноцитов зрелых макрофагов (фенотип M0) и поляризованных макрофагов с фенотипами M1 и M2 индуцировать ангиогенез in vivo и продемонстрировали, что только макрофаги M2 приближаются к высокой ангиогенной способности нейтрофилов. Кроме того, мы определили, что ангиогенная способность макрофагов M2 критически зависит от продукции легко активируемого профермента proMMP-9, поскольку поляризация M2 неожиданно сопровождается существенным подавлением TIMP-1.Наконец, сравнительный анализ макрофагов, происходящих из костного мозга мышей (КМ), показал, что макрофаги М2 мыши также прекращают выработку своего ТИМП-1 и инициируют секрецию ангиогенного, дефицитного по ТИМП-1 проММП-9. Важно отметить, что Mmp9 -нулевые макрофаги M2 были низкими или неангиогенными, но все же подавляли их, TIMP-1, подтверждая критическую зависимость ангиогенеза, индуцированного макрофагами M2, во-первых, от их секретируемого proMMP-9 и, во-вторых, от биохимического статуса профермент.В совокупности наши данные показывают, что продукция проММП-9 с дефицитом ТИМП может лежать в основе объединяющего молекулярного механизма, определяющего высокую ангиогенную активность проММП-9, доставляемого в воспаленные ткани нейтрофилами и / или М2-поляризованными макрофагами.

Фракции гранулоцитов и мононуклеарных клеток были выделены из периферической крови человека. Гранулоцитарная фракция была представлена ​​в основном нейтрофилами (97-99%), и дальнейшее разделение мононуклеарных клеток привело к высокоочищенным фракциям лимфоцитов (96-99%) и моноцитов (92-98%) (Рисунок 1A).

Рисунок 1

Созревание и поляризация макрофагов человека и экспрессия характерных маркеров M1 и M2. (A) Выделение отдельных популяций клеток из периферической крови. Гранулоциты, моноциты и лимфоциты были фракционированы из периферической крови здоровых доноров. Мазки цельной крови и изолированных клеток окрашивали для анализа чистоты отдельных популяций клеток. Репрезентативные изображения окрашенных клеток демонстрируют высокую чистоту фракций нейтрофилов (97-99% гранулоцитарной фракции), лимфоцитов (96-99%) и моноцитов (92-98%).Изображения были получены с использованием микроскопа Olympus BX60 (Olympus America, Мелвилл, Нью-Йорк), оснащенного цифровой видеокамерой DVC и высокопроизводительным программным обеспечением для получения плагинов ImageJ (DVC Company, Остин, Техас), и обработаны с помощью Adobe Photoshop. Объектив, × 40. (B) Созревание и поляризация макрофагов. Очищенные моноциты инкубировали в течение 7 дней с M-CSF для дифференцировки в зрелые макрофаги (фенотип M0). Затем макрофаги M0 поляризовали в течение дополнительных 2 дней в макрофагах M1 путем замены M-CSF на смесь LPS и IFNγ и в макрофаги M2 путем стимуляции IL-4.Обратите внимание на изменения в морфологии округлых, слабо прилегающих моноцитов к удлиненным, прочно прилегающим макрофагам M0, которые сохранили свою морфологию M0, поляризовавшись в макрофаги M1, и стали более округлыми и менее липкими после поляризации M2. Фазово-контрастные изображения получали с помощью микроскопа Olympus CKX-41, оснащенного видеокамерой Olympus U-LS30-3 (Olympus America, Center Valley, PA) и программного обеспечения Infinity Capture (Lumenera, Оттава, Канада), и обрабатывали с помощью Adobe Photoshop. Объектив, 20 ×.(C) Анализ экспрессии MMR. Иммуноцитохимическое окрашивание проводили на MMR (CD206) на проницаемых клетках для визуализации как клеточной поверхности, так и внутриклеточных пулов белка. Окрашивание указывает на то, что MMR (зеленый) не обнаруживается в свежевыделенных нейтрофилах и моноцитах. Экспрессия MMR умеренно индуцируется во время дифференцировки моноцитов в макрофаги M0, но ингибируется во время поляризации в макрофаги M1. Напротив, поляризация M2 сопровождается значительным увеличением уровней экспрессии MMR.Ядра клеток окрашивали 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (синий). Изображения получали с помощью микроскопа Carl Zeiss AxioImager M1m, оснащенного программным обеспечением AxioVision Re.4.6 (Carl Zeiss Microscopy, Торнвуд, Нью-Йорк), и обрабатывали с помощью Adobe Photoshop. Объектив, × 40. Вставленные числовые данные представляют уровни экспрессии MMR на клеточной поверхности, определенные с помощью проточной цитометрии. Указана средняя интенсивность флуоресценции, определенная после вычитания неспецифических значений для мышиного IgG. (D) Анализ экспрессии α-аргиназы-1.(Верхний) Вестерн-блот-анализ на α-аргиназу-1 проводили на лизатах клеток, разделенных электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) в восстанавливающих условиях (40 мкг белка на дорожку). Α-аргиназа-1 массой 38 кДа обнаруживается в макрофагах M0 и M2. (Нижний) Блот повторно зондировали на β-актин (42 кДа), чтобы обеспечить контроль загрузки. Положение маркеров молекулярной массы в килодальтонах указано слева. Гистограмма, анализ экспрессии гена ARG1 и . Количественный анализ ARG1 проводили на препаратах мРНК, выделенных из моноцитов и макрофагов, в сравнении с соответствующими уровнями генов домашнего хозяйства GAPDH и ACTB .Уровни экспрессии генов определяли относительно моноцитов (1,0). Анализ экспрессии белков и генов показывает, что экспрессия α-аргиназы-1 индуцируется во время созревания макрофагов из аргиназа-отрицательных моноцитов и резко ингибируется во время поляризации макрофагов M0 в фенотип M1, но не M2. (E) Анализ выражения iNOS. (Вверху) Клеточные лизаты зрелых и поляризованных макрофагов (20 мкг на дорожку) анализировали на iNOS с помощью вестерн-блоттинга в восстанавливающих условиях, подтверждая индукцию iNOS 130 кДа в макрофагах M2.(Нижний) Блот повторно зондировали на α-тубулин (Biolegend), чтобы обеспечить равный контроль нагрузки. Положение маркеров молекулярной массы в килодальтонах указано слева. Гистограмма, анализ экспрессии гена NOS2 . Количественный анализ NOS2 проводили на препаратах мРНК, выделенных из макрофагов, в сравнении с соответствующими уровнями β-актина. Уровни экспрессии генов определяли относительно макрофагов M0 (1,0). Анализ экспрессии белков и генов показывает, что экспрессия iNOS индуцируется во время поляризации макрофагов M0 по отношению к фенотипу M1, но не M2.

Рисунок 1

Созревание и поляризация макрофагов человека и экспрессия характерных маркеров M1 и M2. (A) Выделение отдельных популяций клеток из периферической крови. Гранулоциты, моноциты и лимфоциты были фракционированы из периферической крови здоровых доноров. Мазки цельной крови и изолированных клеток окрашивали для анализа чистоты отдельных популяций клеток. Репрезентативные изображения окрашенных клеток демонстрируют высокую чистоту фракций нейтрофилов (97-99% гранулоцитарной фракции), лимфоцитов (96-99%) и моноцитов (92-98%).Изображения были получены с использованием микроскопа Olympus BX60 (Olympus America, Мелвилл, Нью-Йорк), оснащенного цифровой видеокамерой DVC и высокопроизводительным программным обеспечением для получения плагинов ImageJ (DVC Company, Остин, Техас), и обработаны с помощью Adobe Photoshop. Объектив, × 40. (B) Созревание и поляризация макрофагов. Очищенные моноциты инкубировали в течение 7 дней с M-CSF для дифференцировки в зрелые макрофаги (фенотип M0). Затем макрофаги M0 поляризовали в течение дополнительных 2 дней в макрофагах M1 путем замены M-CSF на смесь LPS и IFNγ и в макрофаги M2 путем стимуляции IL-4.Обратите внимание на изменения в морфологии округлых, слабо прилегающих моноцитов к удлиненным, прочно прилегающим макрофагам M0, которые сохранили свою морфологию M0, поляризовавшись в макрофаги M1, и стали более округлыми и менее липкими после поляризации M2. Фазово-контрастные изображения получали с помощью микроскопа Olympus CKX-41, оснащенного видеокамерой Olympus U-LS30-3 (Olympus America, Center Valley, PA) и программного обеспечения Infinity Capture (Lumenera, Оттава, Канада), и обрабатывали с помощью Adobe Photoshop. Объектив, 20 ×.(C) Анализ экспрессии MMR. Иммуноцитохимическое окрашивание проводили на MMR (CD206) на проницаемых клетках для визуализации как клеточной поверхности, так и внутриклеточных пулов белка. Окрашивание указывает на то, что MMR (зеленый) не обнаруживается в свежевыделенных нейтрофилах и моноцитах. Экспрессия MMR умеренно индуцируется во время дифференцировки моноцитов в макрофаги M0, но ингибируется во время поляризации в макрофаги M1. Напротив, поляризация M2 сопровождается значительным увеличением уровней экспрессии MMR.Ядра клеток окрашивали 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (синий). Изображения получали с помощью микроскопа Carl Zeiss AxioImager M1m, оснащенного программным обеспечением AxioVision Re.4.6 (Carl Zeiss Microscopy, Торнвуд, Нью-Йорк), и обрабатывали с помощью Adobe Photoshop. Объектив, × 40. Вставленные числовые данные представляют уровни экспрессии MMR на клеточной поверхности, определенные с помощью проточной цитометрии. Указана средняя интенсивность флуоресценции, определенная после вычитания неспецифических значений для мышиного IgG. (D) Анализ экспрессии α-аргиназы-1.(Верхний) Вестерн-блот-анализ на α-аргиназу-1 проводили на лизатах клеток, разделенных электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) в восстанавливающих условиях (40 мкг белка на дорожку). Α-аргиназа-1 массой 38 кДа обнаруживается в макрофагах M0 и M2. (Нижний) Блот повторно зондировали на β-актин (42 кДа), чтобы обеспечить контроль загрузки. Положение маркеров молекулярной массы в килодальтонах указано слева. Гистограмма, анализ экспрессии гена ARG1 и . Количественный анализ ARG1 проводили на препаратах мРНК, выделенных из моноцитов и макрофагов, в сравнении с соответствующими уровнями генов домашнего хозяйства GAPDH и ACTB .Уровни экспрессии генов определяли относительно моноцитов (1,0). Анализ экспрессии белков и генов показывает, что экспрессия α-аргиназы-1 индуцируется во время созревания макрофагов из аргиназа-отрицательных моноцитов и резко ингибируется во время поляризации макрофагов M0 в фенотип M1, но не M2. (E) Анализ выражения iNOS. (Вверху) Клеточные лизаты зрелых и поляризованных макрофагов (20 мкг на дорожку) анализировали на iNOS с помощью вестерн-блоттинга в восстанавливающих условиях, подтверждая индукцию iNOS 130 кДа в макрофагах M2.(Нижний) Блот повторно зондировали на α-тубулин (Biolegend), чтобы обеспечить равный контроль нагрузки. Положение маркеров молекулярной массы в килодальтонах указано слева. Гистограмма, анализ экспрессии гена NOS2 . Количественный анализ NOS2 проводили на препаратах мРНК, выделенных из макрофагов, в сравнении с соответствующими уровнями β-актина. Уровни экспрессии генов определяли относительно макрофагов M0 (1,0). Анализ экспрессии белков и генов показывает, что экспрессия iNOS индуцируется во время поляризации макрофагов M0 по отношению к фенотипу M1, но не M2.

Чтобы вызвать дифференцировку в макрофаги, моноциты инкубировали в присутствии M-CSF (рис. 1B). Во время 7-дневной дифференцировки моноцитарные клетки становятся больше и более плоскими. Зрелые макрофаги M0 затем поляризовали в макрофаги M1 или макрофаги M2 путем индукции LPS / IFN-γ или IL-4 соответственно. Хотя поляризация в фенотип M1 не вызывала серьезных изменений в морфологии клеток, поляризация в сторону фенотипа M2 давала более округлые и слабо прикрепленные клетки (Рисунок 1B).

Иммуноцитохимическое окрашивание, выделяющее в основном пул внутриклеточных белков, продемонстрировало, что MMR, CD206, не обнаруживаемый в очищенных нейтрофилах и моноцитах, незначительно индуцировался в макрофагах M0, подавлялся во время поляризации M1, но значительно повышался в макрофагах M2 (рис. 1C). Проточная цитометрия показала, что только макрофаги M2 экспрессировали высокие уровни MMR на своей клеточной поверхности (средние данные интенсивности флуоресценции на рисунке 1C и в дополнительной таблице 1).Дифференциация моноцитов в макрофаги M0 сопровождалась индукцией α-аргиназы-1, которая стала неопределяемой во время поляризации M1, оставаясь незатронутой в макрофагах M2 (рис. 1D, вверху). Характер экспрессии белка α-аргиназы-1 близко соответствовал таковому для гена ARG1 (рис. 1D, гистограмма). Вестерн-блоттинг и анализ экспрессии генов показали, что поляризация M1 сопровождалась индукцией NOS2 и кодируемого им белка iNOS (рис. 1E). Моноциты и макрофаги M0, M1 и M2 также анализировали на несколько маркеров поверхности миелоидных клеток, включая CD80, CD86 и CD181 (CXCR1), с помощью проточной цитометрии (дополнительная таблица 1), демонстрируя различные уровни индукции во всех 3 типах макрофагов.

Вместе наши биохимические и маркерные анализы подтвердили правильные фенотипы дифференцированных и поляризованных макрофагов и подтвердили их дальнейшие сравнения в критических функциональных анализах in vivo.

Модель живого куриного эмбриона 44 использовалась для сравнения ангиогенных потенциалов нейтрофилов, моноцитов и макрофагов фенотипов M0, M1 и M2 (рис. 2A, вверху).Коллагеновые растения, содержащие 1,5 × 10 4 клеток каждого типа, прививали на САМ. Микроскопическая оценка показала высокие уровни ангиогенеза, индуцированного интактными нейтрофилами и макрофагами M2 (рис. 2А, ниже). Количественный анализ подтвердил, что нейтрофилы и макрофаги M2 индуцировали самые высокие уровни ангиогенеза (от 8 до 12 раз по сравнению с неклеточным контролем), тогда как недифференцированные моноциты давали ангиогенез, который едва превышал фоновые уровни, а макрофаги M0 / M1 демонстрировали ангиогенез от низкого до умеренного. побуждающие способности (рис. 2В).

Рисунок 2

Сравнительный анализ ангиогенных возможностей нейтрофилов, моноцитов, зрелых и поляризованных макрофагов человека. (A) Ангиогенный потенциал интактных лейкоцитов в модели ангиогенеза САМ in vivo. (Верхний) Свежеочищенные нейтрофилы и моноциты, а также макрофаги фенотипов M0, M1 и M2 были включены в двухуровневые сетчатые трехмерные коллагеновые растения (3 × 10 4 клеток / растение), которые были трансплантированы на САМ куриных эмбрионов. .Изображения были получены с помощью микроскопа Olympus CKX-41, оснащенного видеокамерой Olympus U-LS30-3 и программой Infinity Capture, и обработаны с помощью Adobe Photoshop. Объектив, × 20. (Нижний) После 76 часов инкубации растения оценивали на наличие вновь развившихся ангиогенных сосудов, отчетливо локализованных над плоскостью нижних сеток (желтые стрелки). Изображения были получены с использованием бинокулярного микроскопа Olympus SZ-PT (Olympus America, Мелвилл, Нью-Йорк), оснащенного видеокамерой DVC и высокопроизводительным программным обеспечением для сбора данных с подключаемым модулем ImageJ.Объектив, 10 ×. (B) Способность интактных клеток индуцировать ангиогенез. Уровни ангиогенеза количественно оценивали для отдельных растений как отношение решеток, содержащих новые кровеносные сосуды, к общему количеству оцененных решеток, обеспечивая ангиогенный индекс. От 4 до 6 эмбрионов, каждому из которых было пересажено 6 коллагеновых растений, были проанализированы в 3 независимых экспериментах. На диаграмме рассеяния представлены кратные изменения уровней ангиогенеза по сравнению с отрицательным бесклеточным (NC) контролем (1,0). Линии представляют собой средние значения кратных изменений ангиогенных индексов.** P <0,01; *** P <0,0001. (C) Сравнительный анализ зрелых и поляризованных макрофагов в модели ангиотрубок мыши. Интактные жизнеспособные макрофаги M0, M1 и M2 были включены в 2,5 мг / мл нативного коллагена из расчета 2 × 10 6 клеток / мл. Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) использовали в качестве отрицательного бесклеточного контроля (NC). Смеси коллагена полимеризовали в трубках длиной ~ 1 см (ангиотрубках), которые хирургическим путем имплантировали под кожу иммунодефицитных мышей. Ангиотрубки вырезали у мышей через 12-14 дней после имплантации (изображения вверху).Содержимое ангиотрубок лизировали в равных объемах лизирующего буфера и определяли концентрацию гемоглобина, обеспечивая измерения способности тестируемых клеток индуцировать ангиогенез. На диаграмме рассеяния представлены кратные изменения уровней ангиогенеза, индуцированного различными типами макрофагов, по сравнению с отрицательным контролем NC (1,0). Линии представляют собой средства изменения кратности. Показан типичный эксперимент из 2 независимых экспериментов, в каждом из которых использовалось от 4 до 5 мышей, каждому имплантировано 4 ангиотрубки.** P <0,01; *** P <0,0001, между средними значениями из экспериментальных групп по сравнению с контролем NC.

Рисунок 2

Сравнительный анализ ангиогенных возможностей нейтрофилов человека, моноцитов, зрелых и поляризованных макрофагов. (A) Ангиогенный потенциал интактных лейкоцитов в модели ангиогенеза САМ in vivo. (Верхний) Свежеочищенные нейтрофилы и моноциты, а также макрофаги фенотипов M0, M1 и M2 были включены в двухуровневые сетчатые трехмерные коллагеновые растения (3 × 10 4 клеток / растение), которые были трансплантированы на САМ куриных эмбрионов. .Изображения были получены с помощью микроскопа Olympus CKX-41, оснащенного видеокамерой Olympus U-LS30-3 и программой Infinity Capture, и обработаны с помощью Adobe Photoshop. Объектив, × 20. (Нижний) После 76 часов инкубации растения оценивали на наличие вновь развившихся ангиогенных сосудов, отчетливо локализованных над плоскостью нижних сеток (желтые стрелки). Изображения были получены с использованием бинокулярного микроскопа Olympus SZ-PT (Olympus America, Мелвилл, Нью-Йорк), оснащенного видеокамерой DVC и высокопроизводительным программным обеспечением для сбора данных с подключаемым модулем ImageJ.Объектив, 10 ×. (B) Способность интактных клеток индуцировать ангиогенез. Уровни ангиогенеза количественно оценивали для отдельных растений как отношение решеток, содержащих новые кровеносные сосуды, к общему количеству оцененных решеток, обеспечивая ангиогенный индекс. От 4 до 6 эмбрионов, каждому из которых было пересажено 6 коллагеновых растений, были проанализированы в 3 независимых экспериментах. На диаграмме рассеяния представлены кратные изменения уровней ангиогенеза по сравнению с отрицательным бесклеточным (NC) контролем (1,0). Линии представляют собой средние значения кратных изменений ангиогенных индексов.** P <0,01; *** P <0,0001. (C) Сравнительный анализ зрелых и поляризованных макрофагов в модели ангиотрубок мыши. Интактные жизнеспособные макрофаги M0, M1 и M2 были включены в 2,5 мг / мл нативного коллагена из расчета 2 × 10 6 клеток / мл. Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) использовали в качестве отрицательного бесклеточного контроля (NC). Смеси коллагена полимеризовали в трубках длиной ~ 1 см (ангиотрубках), которые хирургическим путем имплантировали под кожу иммунодефицитных мышей. Ангиотрубки вырезали у мышей через 12-14 дней после имплантации (изображения вверху).Содержимое ангиотрубок лизировали в равных объемах лизирующего буфера и определяли концентрацию гемоглобина, обеспечивая измерения способности тестируемых клеток индуцировать ангиогенез. На диаграмме рассеяния представлены кратные изменения уровней ангиогенеза, индуцированного различными типами макрофагов, по сравнению с отрицательным контролем NC (1,0). Линии представляют собой средства изменения кратности. Показан типичный эксперимент из 2 независимых экспериментов, в каждом из которых использовалось от 4 до 5 мышей, каждому имплантировано 4 ангиотрубки.** P <0,01; *** P <0,0001, между средними значениями из экспериментальных групп по сравнению с контролем NC.

Чтобы убедиться, что ангиогенный дифференциал, проявляемый макрофагами, не ограничивается птичьей системой, мы использовали количественный анализ ангиогенеза у мышей. 28,34,42 Подобно модели CAM, макрофаги M2 в мышиной системе индуцировали самые высокие уровни ангиогенеза по сравнению с макрофагами M0 или M1, о чем свидетельствует появление ангиотрубок (рис. 2С, вверху) и количественное определение содержания в них гемоглобина ( Рисунок 2C, диаграмма рассеяния).Эти данные показывают, что поляризация макрофагов в фенотип M2 сопровождается значительным увеличением их способности индуцировать ангиогенез.

Поскольку высокий ангиогенный потенциал нейтрофилов был связан с их предварительно сохраненным proMMP-9, 31,34 , мы проверили, связаны ли ангиогенные потенциалы различных типов макрофагов с их секретируемым proMMP-9. Первоначально мы исследовали кинетику экспрессии proMMP-9 во время дифференцировки и поляризации макрофагов.Во время 7-дневного созревания моноциты морфологически изменяются от слабо прикрепленных круглых клеток к более прочно закрепленным зрелым макрофагам (рис. 3А). Продукция proMMP-9 была индуцирована на 3-й день и достигла наивысших уровней между 5 и 7-м днем ​​(Рисунок 3B, слева), и на нее не оказала значительного влияния поляризация M1 или M2 (Рисунок 3B, посередине). Анализ видов ММР-9, продуцируемых макрофагами, в сравнении с нейтрофилами показал, что в отличие от 3 различных форм, характерных для нейтрофилов проММП-9 (рис. 3В, справа), большая часть макрофагов проММП-9 была представлена ​​мономерами с некоторым образованием димеров.Количественная оценка клеточной продукции проММП-9 по сравнению с известными количествами рекомбинантной человеческой ММП-9 в тех же гелях показывает, что в течение 30-60-минутной дегрануляции нейтрофилы могут высвобождать от 1 до 2 мкг предварительно сохраненного проММП-9 на 1 × 10 6 , в то время как зрелым макрофагам M0 и поляризованным макрофагам M1 и M2 требуется 48 часов, чтобы секретировать от 0,5 до 5 мкг на 1 × 10 6 клеток (рис. 3B; дополнительный рис. 1A). Эта уникальная способность нейтрофилов поставлять легко доступный proMMP-9 дополнительно подчеркивается иммунофлуоресцентным окрашиванием, демонстрирующим, что, хотя макрофаги M0, M1 и M2 являются MMP-9-положительными, нейтрофилы загружены большим грузом MMP-9 (рис. 3C). .

Рисунок 3

Индукция проММП-9 во время созревания и поляризации макрофагов человека. (A) Морфологические изменения при дифференцировке моноцитов в макрофаги. Свежевыделенные моноциты инкубировали в присутствии M-CSF в течение 7 дней. Обратите внимание на постепенное изменение морфологии от округлых моноцитов к удлиненным клеткам, впервые заметное на 3-й день и представляющее почти все макрофаги M0 на 7-й день.Изображения были получены с помощью микроскопа Olympus CKX-41, оснащенного видеокамерой Olympus U-LS30-3 и программой Infinity Capture, и обработаны с помощью Adobe Photoshop. Объектив, × 20. (B) Кинетический анализ продукции proMMP-9 во время созревания и поляризации макрофагов. (Слева) Желатиновая зимография проводилась на бессывороточной (SF) среде, кондиционированной 2 × 10 4 человеческих моноцитов, культивированных в присутствии M-CSF в течение 7 дней, а затем поляризованных в макрофаги M1 или M2. Положение 92 кДа мономера proMMP-9 и гомодимера 200 кДа указано справа.Был загружен рекомбинантный проММР-9 человека, чтобы обеспечить средства количественной оценки продукции проММП-9. (Справа) Зимографический анализ содержимого гранул, выделяемых нейтрофилами 1 × 10 4 . Положение 92 кДа мономера proMMP-9, 125 кДа гетеродимера NGAL и гомодимера 200 кДа указано справа. Человеческий рекомбинантный проММП-9 (3 нг на дорожку) анализировали для оценки нагрузки ММП-9 в нейтрофилах. (C) Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии MMP-9 в изолированных нейтрофилах и моноцитах, а также в зрелых и поляризованных макрофагах.Макрофаги были дифференцированы от моноцитов, культивированных на покровных стеклах, тогда как очищенные нейтрофилы и моноциты были непосредственно помещены на покровные стекла после выделения клеток. Клетки фиксировали, а затем окрашивали на человеческий ММР-9 с помощью mAb 8-3H (зеленый). Ядра клеток контрастировали 4’6 диамидино-2-фенилиндолом (синий). Изображения были получены с использованием микроскопа Carl Zeiss AxioImager M1m, оснащенного программным обеспечением AxioVision Re.4.6, и обработаны с помощью Adobe Photoshop. Объектив, × 40.

Рисунок 3

Индукция проММП-9 во время созревания и поляризации макрофагов человека. (A) Морфологические изменения при дифференцировке моноцитов в макрофаги. Свежевыделенные моноциты инкубировали в присутствии M-CSF в течение 7 дней. Обратите внимание на постепенное изменение морфологии от округлых моноцитов до удлиненных клеток, впервые заметное на 3-й день и представляющее почти все макрофаги M0 на 7-й день. Изображения были получены с помощью микроскопа Olympus CKX-41, оснащенного видеокамерой Olympus U-LS30-3 и Программное обеспечение Infinity Capture и обработано с помощью Adobe Photoshop. Объектив, × 20.(B) Кинетический анализ продукции proMMP-9 во время созревания и поляризации макрофагов. (Слева) Желатиновая зимография проводилась на бессывороточной (SF) среде, кондиционированной 2 × 10 4 человеческих моноцитов, культивированных в присутствии M-CSF в течение 7 дней, а затем поляризованных в макрофаги M1 или M2. Положение 92 кДа мономера proMMP-9 и гомодимера 200 кДа указано справа. Был загружен рекомбинантный проММР-9 человека, чтобы обеспечить средства количественной оценки продукции проММП-9. (Справа) Зимографический анализ содержимого гранул, выделяемых нейтрофилами 1 × 10 4 .Положение 92 кДа мономера proMMP-9, 125 кДа гетеродимера NGAL и гомодимера 200 кДа указано справа. Человеческий рекомбинантный проММП-9 (3 нг на дорожку) анализировали для оценки нагрузки ММП-9 в нейтрофилах. (C) Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии MMP-9 в изолированных нейтрофилах и моноцитах, а также в зрелых и поляризованных макрофагах. Макрофаги были дифференцированы от моноцитов, культивированных на покровных стеклах, тогда как очищенные нейтрофилы и моноциты были непосредственно помещены на покровные стекла после выделения клеток.Клетки фиксировали, а затем окрашивали на человеческий ММР-9 с помощью mAb 8-3H (зеленый). Ядра клеток контрастировали 4’6 диамидино-2-фенилиндолом (синий). Изображения были получены с использованием микроскопа Carl Zeiss AxioImager M1m, оснащенного программным обеспечением AxioVision Re.4.6, и обработаны с помощью Adobe Photoshop. Объектив, × 40.

Используя аффинную хроматографию на желатин-сефарозе, мы выделили proMMP-9 из 30-минутного рилизата нейтрофилов и из 48-часового CM моноцитов и макрофагов M0, M1 и M2 и подтвердили, что все типы моноцитарных клеток секретируют в основном мономер профермента 92 кДа. (дополнительный рисунок 1B).Чтобы охарактеризовать ангиогенный потенциал проММР-9, продуцируемый различными лейкоцитами, очищенный проММР-9 был включен в коллаген на растениях в той же концентрации 1,1 нМ (100 нг / мл; 3 нг на растение) (рис. 4A, вставка). Количественная оценка ангиогенеза продемонстрировала, что проММР-9, продуцируемый нейтрофилами и макрофагами М2, дает самые высокие уровни ангиогенеза (фиг. 4A, гистограмма). Напротив, проММР-9, продуцируемый моноцитами, а также макрофагами М0 и М1, индуцировал относительно низкие уровни ангиогенеза, даже несмотря на то, что использовались равные количества проММР-9, очищенного из разных типов клеток.Чтобы оценить предполагаемый вклад в ангиогенез секретируемых белков, отличных от проММР-9, мы протестировали несвязанные с желатином фракции, которые демонстрировали мало или не проявляли выявляемого зимографией proMMP-9, но содержали> 95% общего белка, продуцируемого клетками (вставка на рисунке 4B и дополнительном рисунке 1B). Эти обедненные proMMP-9 фракции были неспособны индуцировать значительный ангиогенез (фиг. 4B, гистограмма), что указывает на то, что большая часть индуцирующего ангиогенез фрагмента, секретируемого макрофагами, содержится в их секретируемом proMMP-9.

Рисунок 4

Секретируемый проММР-9 и его активация определяют способность моноцитов и макрофагов человека индуцировать ангиогенез. (A) Сравнительный анализ способности очищенного proMMP-9 индуцировать ангиогенез, продуцируемого различными типами клеток. ProMMP-9, высвобождаемый нейтрофилами или секретируемый в среду SF моноцитами или макрофагами, очищали с помощью аффинной хроматографии и включали в смесь коллагена с получением 3 нг proMMP-9 на одно растение.Контрольные растения содержали только PBS. (Вверху) Зимографические изображения над соответствующими столбиками на графике ниже показывают равное количество добавок proMMP-9 в растения. Треугольники указывают положения мономера, гетеродимера и гомодимера проММП-9, высвобождаемого нейтрофилами (слева), и мономера проММП-9, секретируемого моноцитами и макрофагами (справа). Гистограмма, уровни ангиогенеза определяли, как описано на Фигуре 2В. От 4 до 6 эмбрионов, каждый с трансплантированным 6 коллагеном на растении, анализировали по переменной в 3 независимых экспериментах.Объединенные данные показаны в виде кратных изменений (среднее значение ± стандартная ошибка среднего) уровней ангиогенеза, индуцированного проММР-9, продуцируемым различными типами клеток, по сравнению с контролем PBS (1,0). Обратите внимание, что, хотя все протестированные очищенные проММР-9 индуцировали ангиогенез на уровнях, значительно превышающих уровни, наблюдаемые в контроле с PBS, равные количества проММР-9, продуцируемые разными типами клеток, индуцируют разные уровни ангиогенеза (*** P <0,0001 ). (B) Способность секретата, продуцируемого моноцитами и макрофагами, индуцировать ангиогенез, содержится в проММР-9.(Верхний) Проточные фракции, обедненные proMMP-9 с помощью аффинной хроматографии (сравните зимографические изображения в B и A), но содержащие> 95% исходного содержания белка (вставки из окрашенных серебром гелей, расположенные под зимографическими изображениями), были включены в коллаген на растении в количествах, равных количеству продуцируемых таким же количеством клеток (1,5 × 10 4 / на растении). Открытый треугольник на зимограмме указывает положение, в котором полоса proMMP-9 будет локализована до истощения.Столбчатая диаграмма, уровни ангиогенеза определяли через 3 дня, как показано на фиг. 2В. Данные взяты из репрезентативного эксперимента с использованием от 4 до 6 эмбрионов на вариант. Столбцы представляют собой средние значения ± SEM кратных изменений уровней ангиогенеза, индуцированного клеточными секретатами, истощенными по проММР-9, по сравнению с контролем PBS (1,0). (C) Активация проММР-9, продуцируемого интактными клетками, необходима для индукции ангиогенеза. Интактные нейтрофилы и макрофаги M1 или M2 были включены в коллаген на растениях (1.5 × 10 4 клеток / растение) вместе с 2 мкг / мл либо mAb 8-3H, которое связывается с proMMP-9, но не блокирует активацию профермента, либо mAb 7-11C, которое эффективно блокирует активация проММП-9 в протеолитически способный фермент ММП-9. Контрольные растения содержали только PBS. Уровни ангиогенеза определяли, как описано на фиг. 2В. Для каждого варианта от 4 до 6 эмбрионов с трансплантированными 6 коллагеновыми растениями анализировали в 2 независимых экспериментах. Объединенные данные показаны как кратные изменения уровней ангиогенеза, индуцированного различными типами клеток, по сравнению с контролем PBS (1.0). Столбцы представляют собой средние значения ± SEM кратных изменений ангиогенных индексов. *** P <0,0001. (D) Активация проММР-9, секретируемого макрофагами, необходима для индукции ангиогенеза. Релизат нейтрофилов и SF CM из макрофагов M1 или M2 включали в коллагеновые растения в количестве 1,5 нг proMMP-9 на растение вместе с 2 мкг / мл MMP-9-специфических mAb, а именно контрольных mAb 8-3H или mAb 7, блокирующих активацию. -11С. Контрольные растения содержали только PBS. Уровни ангиогенеза определяли, как описано на фиг. 2В.Данные взяты из репрезентативного эксперимента с использованием от 4 до 6 эмбрионов на вариант. Столбики представляют собой средние значения ± SEM кратных изменений уровней ангиогенеза, индуцированного CM из разных типов клеток, по сравнению с контролем PBS (1,0). ** P <0,005; *** P <0,0001.

Рисунок 4

Секретируемый проММР-9 и его активация определяют способность моноцитов и макрофагов человека индуцировать ангиогенез. (A) Сравнительный анализ способности очищенного proMMP-9 индуцировать ангиогенез, продуцируемого различными типами клеток.ProMMP-9, высвобождаемый нейтрофилами или секретируемый в среду SF моноцитами или макрофагами, очищали с помощью аффинной хроматографии и включали в смесь коллагена с получением 3 нг proMMP-9 на одно растение. Контрольные растения содержали только PBS. (Вверху) Зимографические изображения над соответствующими столбиками на графике ниже показывают равное количество добавок proMMP-9 в растения. Треугольники указывают положения мономера, гетеродимера и гомодимера проММП-9, высвобождаемого нейтрофилами (слева), и мономера проММП-9, секретируемого моноцитами и макрофагами (справа).Гистограмма, уровни ангиогенеза определяли, как описано на Фигуре 2В. От 4 до 6 эмбрионов, каждый с трансплантированным 6 коллагеном на растении, анализировали по переменной в 3 независимых экспериментах. Объединенные данные показаны в виде кратных изменений (среднее значение ± стандартная ошибка среднего) уровней ангиогенеза, индуцированного проММР-9, продуцируемым различными типами клеток, по сравнению с контролем PBS (1,0). Обратите внимание, что, хотя все протестированные очищенные проММР-9 индуцировали ангиогенез на уровнях, значительно превышающих уровни, наблюдаемые в контроле с PBS, равные количества проММР-9, продуцируемые разными типами клеток, индуцируют разные уровни ангиогенеза (*** P <.0001). (B) Способность секретата, продуцируемого моноцитами и макрофагами, индуцировать ангиогенез, содержится в проММР-9. (Верхний) Проточные фракции, обедненные proMMP-9 с помощью аффинной хроматографии (сравните зимографические изображения в B и A), но содержащие> 95% исходного содержания белка (вставки из окрашенных серебром гелей, расположенные под зимографическими изображениями), были включены в коллаген на растении в количествах, равных количеству продуцируемых таким же количеством клеток (1,5 × 10 4 / на растении).Открытый треугольник на зимограмме указывает положение, в котором полоса proMMP-9 будет локализована до истощения. Столбчатая диаграмма, уровни ангиогенеза определяли через 3 дня, как показано на фиг. 2В. Данные взяты из репрезентативного эксперимента с использованием от 4 до 6 эмбрионов на вариант. Столбцы представляют собой средние значения ± SEM кратных изменений уровней ангиогенеза, индуцированного клеточными секретатами, истощенными по проММР-9, по сравнению с контролем PBS (1,0). (C) Активация проММР-9, продуцируемого интактными клетками, необходима для индукции ангиогенеза.Интактные нейтрофилы и макрофаги M1 или M2 были включены в коллаген на растениях (1,5 × 10 4 клеток / растение) вместе с 2 мкг / мл любого mAb 8-3H, которое связывается с проММР-9, но не блокирует активацию. профермента, или mAb 7-11C, которое эффективно блокирует активацию проММП-9 в протеолитически способный фермент ММП-9. Контрольные растения содержали только PBS. Уровни ангиогенеза определяли, как описано на фиг. 2В. Для каждого варианта от 4 до 6 эмбрионов с трансплантированными 6 коллагеновыми растениями анализировали в 2 независимых экспериментах.Объединенные данные показаны как кратные изменения уровней ангиогенеза, индуцированного различными типами клеток, по сравнению с контролем PBS (1,0). Столбцы представляют собой средние значения ± SEM кратных изменений ангиогенных индексов. *** P <0,0001. (D) Активация проММР-9, секретируемого макрофагами, необходима для индукции ангиогенеза. Релизат нейтрофилов и SF CM из макрофагов M1 или M2 включали в коллагеновые растения в количестве 1,5 нг proMMP-9 на растение вместе с 2 мкг / мл MMP-9-специфических mAb, а именно контрольных mAb 8-3H или mAb 7, блокирующих активацию. -11С.Контрольные растения содержали только PBS. Уровни ангиогенеза определяли, как описано на фиг. 2В. Данные взяты из репрезентативного эксперимента с использованием от 4 до 6 эмбрионов на вариант. Столбики представляют собой средние значения ± SEM кратных изменений уровней ангиогенеза, индуцированного CM из разных типов клеток, по сравнению с контролем PBS (1,0). ** P <0,005; *** P <0,0001.

Используя mAb 7-11C, однозначно блокирующее активацию человеческого proMMP-9, 31 , мы определили, что образование фермента MMP-9 из продуцируемого макрофагами зимогена необходимо для индукции ангиогенеза.MAb 7-11C или контрольное, связывающееся с proMMP-9, но неблокирующее, mAb 8-3H, было включено в клетки-коллаген на растениях, содержащих нейтрофилы или поляризованные макрофаги. В параллельных экспериментах вместо интактных клеток тестировали высвобождение нейтрофилов и КМ из макрофагов. MAb 7-11C против MMP-9 вызывало значительное снижение ангиогенеза, вызванного либо интактными клетками (фиг. 4C), либо их секретируемыми продуктами (фиг. 4D), на 80–90%. Резкое ингибирование MMP-9-индуцированного ангиогенеза, вызванного mAb 7-11C, позволило нам сделать вывод, что ангиогенный потенциал нейтрофилов и поляризованных макрофагов зависит от активации их proMMP-9 на каталитически компетентный фермент MMP-9.Кроме того, почти полное снижение клеточно-опосредованного ангиогенеза антителом против активации MMP-9 (фиг. 4C) подтверждает данные на фиг. 4B, демонстрируя, что большая часть ангиогенной способности миелоидных клеток человека in vivo содержалась в их про-ММП-клетках. 9. Могут существовать и другие ангиогенные факторы, продуцируемые макрофагами M2, но такие предполагаемые факторы оказываются гораздо менее эффективными, чем проММР-9, секретируемый интактными клетками in vivo (Рисунок 4C) или in vitro (Рисунок 4B, D).

Различные уровни MMP-9-зависимого ангиогенеза, индуцированного одними и теми же количествами proMMP-9, очищенного от различных типов воспалительных клеток (рис. 4A), предполагают, что структурные или биохимические различия могут определять ангиогенную активность секретируемого proMMP-9.Поскольку высокие уровни ангиогенной способности нейтрофила proMMP-9 определяются его статусом без TIMP, 31,34 мы исследовали, могут ли относительно низкие ангиогенные потенциалы proMMP-9, продуцируемые макрофагами M0 и M1, быть связаны с комплексным TIMP-1. , что задерживает активацию зимогена MMP-9, а также снижает каталитическую активность активированного фермента. Препараты как CM, так и очищенного проММП-9 анализировали вестерн-блоттингом для определения, соответственно, уровней ТИМП-1, продуцируемых различными типами клеток, и уровней ТИМП-1, прочно связанных с очищенным проММП-9.Анализ CM показал, что недифференцированные моноциты секретируют самые высокие уровни ТИМП-1, в то время как продуцируют самые низкие уровни проММП-9 (фиг. 5А, верхняя часть). Дифференцировка моноцитов на макрофаги M0, а также поляризация M1 сопровождались общим снижением продукции TIMP-1. Важно отметить, что наименьшее количество ТИМП-1 секретируется поляризованными макрофагами М2. Вестерн-блоттинг показывает, что 1 × 10 6 нейтрофилов высвобождают от 1 до 2 мкг проММП-9 в течение 20-30 минут после индукции, тогда как макрофагам требуется не менее 24 часов для секреции такого же количества проММП-9 (рис. 5А), подтверждающие наши количественные оценки зимографии (рисунок 3B; дополнительный рисунок 1A).

Рисунок 5

Поляризация M2 макрофагов человека подавляет экспрессию TIMP-1, что приводит к продукции proMMP-9 с высокой ангиогенной недостаточностью TIMP-1. (A) (верхний) Производство проММП-9 и ТИМП-1 моноцитами и зрелыми и поляризованными макрофагами. Релизат нейтрофилов из 5 × 10 клеток 3 и среду SF, кондиционированную 2 × 10 моноцитарными клетками 4 , анализировали на MMP-9 и TIMP-1 с помощью вестерн-блоттинга в невосстанавливающих условиях.После переноса мембрану разрезали на 2 части, которые исследовали на наличие ММП-9 (вверху) и ТИМП-1 (внизу). Рекомбинантные проММП-9 и ТИМП-1 человека обрабатывали в указанных количествах, чтобы обеспечить средства для количественной оценки продукции белка. Слева указаны положения мономера 92 кДа, гетеродимера 125 кДа и гомодимера ∼200 кДа proMMP-9 и 28 кДа TIMP-1. Справа указано положение маркеров молекулярной массы в килодальтонах. Гистограмма, сравнительный анализ способности индуцировать ангиогенез среды, кондиционированной моноцитарными клетками.SF CM из моноцитарных клеток и рилизат нейтрофилов включали в объемах, обеспечивающих равные количества proMMP-9 (3 нг на коллаген на растении). От 4 до 6 эмбрионов, каждый с трансплантированным 6 коллагеном на растении, анализировали по переменной в 5 независимых экспериментах. Гистограмма представляет средние значения ± стандартная ошибка среднего кратных изменений уровней ангиогенеза по сравнению с контролем без клеток (NC, 1,0). ** P <0,01; *** P <0,0001. (B) (верхний) Анализ уровней ТИМП-1 в естественном комплексе с проММП-9, продуцируемым моноцитами и зрелыми и поляризованными макрофагами.ProMMP-9 очищали с помощью аффинной хроматографии из рилизата нейтрофилов и среды SF, кондиционированной моноцитами или различными типами макрофагов. Вестерн-блоттинг выделенных препаратов проММП-9 проводили в восстанавливающих условиях для определения количества ТИМП-1 в комплексе с отдельными препаратами проММП-9. Обратите внимание, что препарат нейтрофилов proMMP-9 полностью лишен TIMP-1, и это восстановление привело к коллапсу всех форм нейтрофилов proMMP-9 до мономеров массой 92 кДа.Положения очищенного мономера проММП-9 и комплексообразующего ТИМП-1 28 кДа указаны слева. Справа указаны позиции маркеров молекулярной массы. Гистограмма, стехиометрическое отношение проММП-9 к ТИМП-1 в очищенных препаратах проММП-9 из моноцитов и макрофагов было рассчитано на основе стандартных количеств рекомбинантных проММП-9 и ТИМП-1, которые запускались параллельно на дополнительных дорожках тот же гель (дополнительный рисунок 1C). *** P <0,0001. (C) Анализ экспрессии генов MMP9 и TIMP1 во время опосредованной IL-4 поляризации M2.Макрофаги M0 вводили в 20 нг / мл IL-4, и мРНК экстрагировали из клеток в указанные моменты времени. Экспрессию гена анализировали количественной цепной реакцией обратной транскриптазы-полимеразы относительно уровней соответствующего гена (1,0) перед добавлением IL-4 (0 часов). Представлены данные 1 из 4 независимых экспериментов, проведенных в трех повторностях. *** P <0,0001. (D) Вестерн-блот-анализ секреции ММР-9 и ТИМП-1 во время поляризации М2, опосредованной ИЛ-4. Макрофаги M0 вводили в IL-4 на указанное время (часы), а затем переводили в условия SF.После 48-часовой инкубации образцы CM анализировали на MMP-9 и TIMP-1 с помощью вестерн-блоттинга. (E) ИЛ-опосредованная регуляция MMP-9 и TIMP-1 в макрофагах M2. Макрофаги M0 вводили с 20 нг / мл человеческого IL-4, IL-10 и IL-13 или оставляли без лечения (NT). После 24-часовой индукции клетки переводили в среду SF и собирали CM через 48 часов. КМ анализировали на MMP-9 и TIMP-1 с помощью вестерн-блоттинга. Образцы CM были нормализованы до равного количества клеток и обработаны SDS PAGE в 4-20% гелях в восстанавливающих условиях.После переноса разделенных белков мембрану разрезали по горизонтали, и верхнюю часть зондировали антителом против MMP-9, а нижнюю часть - антителом против TIMP-1. Положение маркеров молекулярной массы указано справа. (F) Ангиогенный потенциал макрофагов, активированных IL. Ангиогенную активность CM из макрофагов M0, индуцированных различными IL, анализировали в анализе CAM. Данные взяты из 1 из 3 независимых экспериментов, в каждом из которых задействовано от 4 до 6 куриных эмбрионов с 5-6 коллагеновыми растениями.Гистограмма представляет собой средние значения ± SEM кратных изменений уровней ангиогенеза по сравнению с контролем SF (1,0). ** P <0,005 и *** P <0,0001 по сравнению с необработанными (NT) макрофагами.

Рисунок 5

Поляризация M2 макрофагов человека подавляет экспрессию TIMP-1, что приводит к продукции proMMP-9, дефицитного по TIMP-1. (A) (верхний) Производство проММП-9 и ТИМП-1 моноцитами и зрелыми и поляризованными макрофагами.Релизат нейтрофилов из 5 × 10 клеток 3 и среду SF, кондиционированную 2 × 10 моноцитарными клетками 4 , анализировали на MMP-9 и TIMP-1 с помощью вестерн-блоттинга в невосстанавливающих условиях. После переноса мембрану разрезали на 2 части, которые исследовали на наличие ММП-9 (вверху) и ТИМП-1 (внизу). Рекомбинантные проММП-9 и ТИМП-1 человека обрабатывали в указанных количествах, чтобы обеспечить средства для количественной оценки продукции белка. Слева указаны положения мономера 92 кДа, гетеродимера 125 кДа и гомодимера ∼200 кДа proMMP-9 и 28 кДа TIMP-1.Справа указано положение маркеров молекулярной массы в килодальтонах. Гистограмма, сравнительный анализ способности индуцировать ангиогенез среды, кондиционированной моноцитарными клетками. SF CM из моноцитарных клеток и рилизат нейтрофилов включали в объемах, обеспечивающих равные количества proMMP-9 (3 нг на коллаген на растении). От 4 до 6 эмбрионов, каждый с трансплантированным 6 коллагеном на растении, анализировали по переменной в 5 независимых экспериментах. Гистограмма представляет собой средние значения ± SEM кратных изменений уровней ангиогенеза по сравнению с контролем без клеток (NC, 1.0). ** P <0,01; *** P <0,0001. (B) (верхний) Анализ уровней ТИМП-1 в естественном комплексе с проММП-9, продуцируемым моноцитами и зрелыми и поляризованными макрофагами. ProMMP-9 очищали с помощью аффинной хроматографии из рилизата нейтрофилов и среды SF, кондиционированной моноцитами или различными типами макрофагов. Вестерн-блоттинг выделенных препаратов проММП-9 проводили в восстанавливающих условиях для определения количества ТИМП-1 в комплексе с отдельными препаратами проММП-9.Обратите внимание, что препарат нейтрофилов proMMP-9 полностью лишен TIMP-1, и это восстановление привело к коллапсу всех форм нейтрофилов proMMP-9 до мономеров массой 92 кДа. Положения очищенного мономера проММП-9 и комплексообразующего ТИМП-1 28 кДа указаны слева. Справа указаны позиции маркеров молекулярной массы. Гистограмма, стехиометрическое отношение проММП-9 к ТИМП-1 в очищенных препаратах проММП-9 из моноцитов и макрофагов было рассчитано на основе стандартных количеств рекомбинантных проММП-9 и ТИМП-1, которые запускались параллельно на дополнительных дорожках тот же гель (дополнительный рисунок 1C).*** P <0,0001. (C) Анализ экспрессии генов MMP9 и TIMP1 во время опосредованной IL-4 поляризации M2. Макрофаги M0 вводили в 20 нг / мл IL-4, и мРНК экстрагировали из клеток в указанные моменты времени. Экспрессию гена анализировали количественной цепной реакцией обратной транскриптазы-полимеразы относительно уровней соответствующего гена (1,0) перед добавлением IL-4 (0 часов). Представлены данные 1 из 4 независимых экспериментов, проведенных в трех повторностях.*** P <0,0001. (D) Вестерн-блот-анализ секреции ММР-9 и ТИМП-1 во время поляризации М2, опосредованной ИЛ-4. Макрофаги M0 вводили в IL-4 на указанное время (часы), а затем переводили в условия SF. После 48-часовой инкубации образцы CM анализировали на MMP-9 и TIMP-1 с помощью вестерн-блоттинга. (E) ИЛ-опосредованная регуляция MMP-9 и TIMP-1 в макрофагах M2. Макрофаги M0 вводили с 20 нг / мл человеческого IL-4, IL-10 и IL-13 или оставляли без лечения (NT).После 24-часовой индукции клетки переводили в среду SF и собирали CM через 48 часов. КМ анализировали на MMP-9 и TIMP-1 с помощью вестерн-блоттинга. Образцы CM были нормализованы до равного количества клеток и обработаны SDS PAGE в 4-20% гелях в восстанавливающих условиях. После переноса разделенных белков мембрану разрезали по горизонтали, и верхнюю часть зондировали антителом против MMP-9, а нижнюю часть - антителом против TIMP-1. Положение маркеров молекулярной массы указано справа.(F) Ангиогенный потенциал макрофагов, активированных IL. Ангиогенную активность CM из макрофагов M0, индуцированных различными IL, анализировали в анализе CAM. Данные взяты из 1 из 3 независимых экспериментов, в каждом из которых задействовано от 4 до 6 куриных эмбрионов с 5-6 коллагеновыми растениями. Гистограмма представляет собой средние значения ± SEM кратных изменений уровней ангиогенеза по сравнению с контролем SF (1,0). ** P <0,005 и *** P <0,0001 по сравнению с необработанными (NT) макрофагами.

Когда CM из разных типов моноцитарных клеток сравнивали на ангиогенную способность, уровни ангиогенеза обратно коррелировали с уровнями секретируемого TIMP-1.Таким образом, уровни ангиогенеза, индуцированного M2-CM, были сравнимы с уровнями, индуцированными рилизатом нейтрофилов, тогда как CM из моноцитов и макрофагов M0 индуцировали ангиогенез, едва превышая уровни бесклеточного контроля (фиг. 5A, гистограмма). Важно отметить, что, несмотря на идентичные количества proMMP-9, ангиогенная способность M1-CM была меньше половины M2-CM (фиг. 5A). Следует отметить, что при смешивании M0-CM с M2-CM не наблюдалось никаких ингибирующих эффектов на ангиогенез (дополнительная фигура 2), что указывает на то, что это не секреция ингибиторов ангиогенеза неангиогенными макрофагами, а скорее биохимический статус proMMP-9, продуцируемого различные типы макрофагов, ответственные за наблюдаемые ангиогенные различия.Эти данные также указывают на то, что предполагаемый свободный TIMP-1, который может присутствовать в CM из M0-макрофагов, не ингибирует TIMP-дефицитный proMMP-9, продуцируемый макрофагами M2.

Поскольку ангиогенная способность и скорость активации проММП-9 зависят от уровней связанного ТИМП-1, 31,34 мы определили молярные отношения проММП-9 к ТИМП-1 в проММП-9, продуцируемых разными типами клеток (рис. 5B, верхний; дополнительный рисунок 1C).В среднем моноцитарный проММП-9 имел молярное соотношение проММП-9: ТИМП-1 ≤1,0 (фиг. 5В, гистограмма), что указывает на то, что все молекулы проММП-9 образовали комплекс с ТИМП-1. Молярные отношения комплексов проММП-9: ТИМП-1, продуцируемых макрофагами М0 и М1, составляли от 1,4 до 2,0, что указывает на то, что только часть (~ 25-50%) секретируемых молекул проММП-9 не содержала ТИМП-1. С другой стороны, поляризация M2, которая приводит к уменьшению секреции TIMP-1 (фиг. 5A), сопровождалась продуцированием proMMP-9, характеризующегося существенно сниженными уровнями связанного TIMP-1.Основываясь на денситометрическом анализе по сравнению с рекомбинантной лестницей проММР-9 (дополнительный рисунок 1С), очищенные макрофагальные комплексы М2 дали самые высокие молярные отношения проММП-9: ТИМП-1, в среднем достигнув 12,1 ± 0,9 (n = 4) (рисунок 5В). и указывает на то, что ≥90% молекул проММР-9, секретируемых макрофагами М2, не содержат ТИМП-1. Примечательно, что нейтрофилы не производят ТИМП-1 (рис. 5А-В), что приводит к статусу свободных от ТИМП всех высвобожденных ими молекул проММП-9 и убедительно свидетельствует о том, что специфический цитокин-индуцированный дефицит ТИМП-1 может быть основной причиной высокого ангиогенеза индуцирующая способность проММП-9, продуцируемая макрофагами М2.

Чтобы убедиться, что опосредованная цитокинами поляризация M2 сопровождалась подавлением TIMP-1, мы провели кинетический анализ экспрессии TIMP-1 и MMP-9 в макрофагах, обработанных IL-4. Анализ экспрессии генов продемонстрировал относительно стабильные уровни мРНК MMP9 во время поляризации M2, тогда как значительное снижение экспрессии TIMP1 наблюдалось через 6 часов обработки IL-4 (рис. 5C) с последующим значительным снижением белка TIMP-1. в течение следующих 12-48 часов поляризации M2 (рис. 5D).

Чтобы исследовать, является ли подавление TIMP-1 во время поляризации M2 уникальным для IL-4, макрофаги M0 альтернативно обрабатывали цитокинами IL-10 и IL-13, 2, ранее участвовавшими в индукции фенотипа M2. 1,13,45 Подобно IL-4, как IL-10, так и IL-13 поддерживали экспрессию α-аргиназы-1 и не индуцировали экспрессию NOS2 (дополнительная фигура 3A). Однако IL-10 и IL-13 значительно снижали уровни секретируемого TIMP-1, не влияя на уровни proMMP-9 (рис. 5E).Эти данные убедительно указывают на то, что подавление TIMP-1 является общим механизмом, лежащим в основе поляризации M2 различными цитокинами и не уникальным для лечения IL-4. Кроме того, наши анализы ангиогенеза продемонстрировали, что CM из макрофагов M0, обработанных IL-10 или IL-13, был высокоангиогенным и проявлял ангиогенную активность, сравнимую с таковой у IL-4-поляризованных макрофагов M2 (Рисунок 5F). Наконец, оказывается, что индуцированное IL-4 отключение TIMP-1 во время поляризации к фенотипу M2 могло быть специфичным для макрофагов, поскольку оно не происходило в других гематопоэтических линиях, представленных двумя типами лейкозных клеток, промиелобластами HL-60 и U-937. гистиоциты или раковые клетки человека, такие как фибросаркома HT-1080 (дополнительный рисунок 4).

Вместе эти данные указывают на то, что подавление TIMP-1, а не общая повышающая регуляция proMMP-9 может быть общей характеристикой поляризации макрофагов M2.

Чтобы подтвердить, что связанный TIMP-1 определяет высокий ангиогенный потенциал proMMP-9, продуцируемого миелоидными клетками, мы стехиометрически комплексировали рекомбинантный TIMP-1 с нейтрофилом proMMP-9 без TIMP и макрофагом proMMP-9 с дефицитом TIMP и проанализировали ангиогенный потенциал образующихся комплексов.Вестерн-блоттинг подтвердил эффективное, близкое к стехиометрическому 1: 1 связывание TIMP-1 с нейтрофилами proMMP-9 и M2 proMMP-9 (фиг. 6A). Результаты ангиогенеза in vivo показывают, что высокая ангиогенная способность как нейтрофилов proMMP-9, так и макрофагов M2 proMMP-9 снижалась на 80-90%, если их proMMP-9 был стехиометрическим образом образован комплексом с TIMP-1 (фиг. 6B).

Рисунок 6

Статус дефицита ТИМП-1 определяет высокую ангиогенную способность проММП-9, продуцируемого М2-поляризованными макрофагами человека. (A) Комплексообразование нейтрофилов и макрофагов M2 proMMP-9 с TIMP-1. Очищенный нейтрофил proMMP-9, свободный от TIMP, и proMMP-9 с дефицитом TIMP, продуцируемый макрофагами M2, инкубировали с пятикратным молярным избытком TIMP-1 и повторно очищали с помощью аффинной хроматографии на желатиновой сефарозе для удаления несвязанного TIMP-1. Исходные и полученные препараты анализировали вестерн-блоттингом на 92 кДа ММР-9 и 28 кДа ТИМП-1, подтверждая эффективное комплексообразование ТИМП-1 с проММП-9. (B) Обременение TIMP-1 отменяет высокую способность proMMP-9 индуцировать ангиогенез.Препараты исходного и комплексного ТИМП-1 проММР-9 из нейтрофилов и макрофагов М2 включали в смеси коллагена для получения 3 нг проММП-9 на одно растение. Уровни ангиогенеза анализировали через 3 дня по сравнению с контролем PBS. Данные взяты из репрезентативного эксперимента, проведенного с использованием от 4 до 6 эмбрионов, каждый с привитыми 6 коллагеновыми растениями в каждом состоянии. Данные представлены в виде кратных изменений (средние значения ± стандартная ошибка среднего) уровней ангиогенеза, индуцированного различными препаратами проММР-9, по сравнению с контролем PBS (1.0). *** P <0,0001. (C) Подавление экспрессии ТИМП-1 обработкой миРНК. После 7-дневной дифференцировки моноцитов в зрелые макрофаги M0 и поляризации макрофагов M0 на фенотипы M1 и M2 клетки трансфицировали контрольными конструкциями или конструкциями миРНК TIMP-1. КМ из обработанных миРНК зрелых M0 и поляризованных макрофагов M1 и M2 анализировали вестерн-блоттингом на уровни проММР-9 и ТИМП-1. Обратите внимание, что обработка миРНК TIMP-1 не влияла на уровни продукции proMMP-9, но значительно подавляла экспрессию TIMP-1 в макрофагах M0 и M1.(D) Подавление ТИМП-1 в макрофагах М0 и М2, экспрессирующих ТИМП-1, индуцирует их ангиогенную способность. Низкие уровни экспрессии и продукции ТИМП-1 коррелируют с высокими уровнями ангиогенеза, индуцированного зрелыми и поляризованными макрофагами. Зрелые M0 и поляризованные макрофаги M1 и M2 обрабатывали контролем или миРНК TIMP-1 и включали в смеси коллагена для получения 1 × 10 4 клеток на коллаген на растении. Отрицательный контроль не содержал клеток (NC). Данные представлены в виде кратных изменений (средние значения ± SEM) уровней ангиогенеза по сравнению с контролем NC (1.0). Обратите внимание, что значительное подавление TIMP-1 в макрофагах M0 и M1 приводит к значительному увеличению их ангиогенной способности. ** P <0,01.

Рисунок 6

Статус дефицита ТИМП-1 определяет высокую ангиогенную способность проММП-9, продуцируемого М2-поляризованными макрофагами человека. (A) Комплексообразование нейтрофилов и макрофагов M2 proMMP-9 с TIMP-1. Очищенный нейтрофил proMMP-9, свободный от TIMP, и proMMP-9 с дефицитом TIMP, продуцируемый макрофагами M2, инкубировали с пятикратным молярным избытком TIMP-1 и повторно очищали с помощью аффинной хроматографии на желатиновой сефарозе для удаления несвязанного TIMP-1.Исходные и полученные препараты анализировали вестерн-блоттингом на 92 кДа ММР-9 и 28 кДа ТИМП-1, подтверждая эффективное комплексообразование ТИМП-1 с проММП-9. (B) Обременение TIMP-1 отменяет высокую способность proMMP-9 индуцировать ангиогенез. Препараты исходного и комплексного ТИМП-1 проММР-9 из нейтрофилов и макрофагов М2 включали в смеси коллагена для получения 3 нг проММП-9 на одно растение. Уровни ангиогенеза анализировали через 3 дня по сравнению с контролем PBS.Данные взяты из репрезентативного эксперимента, проведенного с использованием от 4 до 6 эмбрионов, каждый с привитыми 6 коллагеновыми растениями в каждом состоянии. Данные представлены в виде кратных изменений (средние значения ± стандартная ошибка среднего) уровней ангиогенеза, индуцированного различными препаратами проММР-9, по сравнению с контролем PBS (1,0). *** P <0,0001. (C) Подавление экспрессии ТИМП-1 обработкой миРНК. После 7-дневной дифференцировки моноцитов в зрелые макрофаги M0 и поляризации макрофагов M0 на фенотипы M1 и M2 клетки трансфицировали контрольными конструкциями или конструкциями миРНК TIMP-1.КМ из обработанных миРНК зрелых M0 и поляризованных макрофагов M1 и M2 анализировали вестерн-блоттингом на уровни проММР-9 и ТИМП-1. Обратите внимание, что обработка миРНК TIMP-1 не влияла на уровни продукции proMMP-9, но значительно подавляла экспрессию TIMP-1 в макрофагах M0 и M1. (D) Подавление ТИМП-1 в макрофагах М0 и М2, экспрессирующих ТИМП-1, индуцирует их ангиогенную способность. Низкие уровни экспрессии и продукции ТИМП-1 коррелируют с высокими уровнями ангиогенеза, индуцированного зрелыми и поляризованными макрофагами.Зрелые M0 и поляризованные макрофаги M1 и M2 обрабатывали контролем или миРНК TIMP-1 и включали в смеси коллагена для получения 1 × 10 4 клеток на коллаген на растении. Отрицательный контроль не содержал клеток (NC). Данные представлены в виде кратных изменений (средние значения ± стандартная ошибка среднего) уровней ангиогенеза по сравнению с контролем NC (1,0). Обратите внимание, что значительное подавление TIMP-1 в макрофагах M0 и M1 приводит к значительному увеличению их ангиогенной способности. ** P <.01.

Чтобы продемонстрировать, что нагрузка TIMP-1 снижает ангиогенный потенциал миелоидного proMMP-9, мы подавили TIMP1 в зрелых и M1-поляризованных макрофагах с помощью конструкции малой интерферирующей РНК (siRNA) и проанализировали способность клеток индуцировать ангиогенез в сравнение с макрофагами М2. Обработка макрофагов M0 и M1 миРНК TIMP-1 приводила к существенному подавлению белка TIMP-1, но не влияла на продукцию proMMP-9 (фиг. 6C).Обработка миРНК ТИМП-1 не вызывала значительных эффектов на ангиогенез, индуцированный уже имеющими дефицит ТИМП-1 макрофагами М2, подтверждая, что обработка миРНК ТИМП-1 не вызывала нецелевых эффектов или неспецифически индуцировала ангиогенез. Однако подавление экспрессии TIMP-1 в макрофагах M0 и M1 вызвало существенное, от трех до пяти раз, увеличение их способности индуцировать ангиогенез (фигура 6D).

В совокупности эти данные указывают на то, что в воспаленных тканях высокое молярное соотношение ангиогенного proMMP-9 к антиангиогенному TIMP-1 будет иметь решающее значение во время образования новых кровеносных сосудов, индуцированного поляризованными макрофагами.

Чтобы подтвердить наши выводы относительно ангиогенных свойств человеческих макрофагов M2 и проММР-9, производных от M2, мы провели исследование ангиогенного потенциала мышиных макрофагов. Клетки ВМ выделяли из мышей WT или Mmp9 -нокаут (KO) и выращивали в присутствии мышиного M-CSF. Во время культивирования клетки ВМ экспрессировали повышенные уровни специфического для макрофагов рецептора F4 / 80. В течение 6-9 дней почти 100% клеток ВМ экспрессировали высокие уровни F4 / 80 (дополнительная таблица 2), что указывает на то, что эти клетки стали полностью зрелыми макрофагами.Макрофаги M0 были поляризованы в фенотипы M1 или M2 путем инкубации с LPS / IFNγ или мышиным IL-4 соответственно (фиг. 7A). Анализ клеточного сортировщика с активацией флуоресценции продемонстрировал экспрессию MMR как в макрофагах M0, так и в M1, но только поляризация M2 индуцировала высокие уровни этого маркера на поверхности клетки (дополнительная таблица 3). В макрофагах WT и Mmp9 -KO проточная цитометрия показала сходные уровни экспрессии F4 / 80 для всех фенотипов макрофагов, тогда как анализ экспрессии генов подтвердил правильную экспрессию генов, которые, как известно, связаны с фенотипом M1 ( Nos2 , Tnf ) 46 и фенотип M2 ( Arg1 , Mrc1 и Ym1 ) 1,47 (дополнительный рисунок 5).Кроме того, вестерн-блот-анализ клеточных лизатов подтвердил реципрокную экспрессию iNOS и α-аргиназы-1 в макрофагах M1 и M2 (дополнительная фигура 6).

Рисунок 7

Ангиогенный потенциал М2-макрофагов, полученных из мышиного BM, зависит от их проММП-9, не содержащего ТИМП-1. (A) Поляризация макрофагов, полученных из мышиного BM. Макрофаги M0 были получены от мышей WT (вверху) или мышей Mmp9, -KO (внизу) путем инкубации клеток ВМ в присутствии мышиного M-CSF.После 7-дневного созревания макрофаги M0 инкубировали в течение 24 часов либо в смеси IFNγ и LPS для индукции фенотипа M1, либо с IL-4 для индукции фенотипа M2. Фазово-контрастные изображения были получены с использованием микроскопа Olympus CKX-41, оснащенного видеокамерой Olympus U-LS30-3 и программой Infinity Capture, и обработаны с помощью Adobe Photoshop. Объектив, × 20. (B) Вестерн-блоттинг MMP-9 и TIMP-1, продуцируемых зрелыми и поляризованными мышиными макрофагами. После созревания и поляризации мышиные макрофаги переводили на среду SF.CM собирали через 48 часов и анализировали на продукцию MMP-9 и TIMP-1. Контрольные белки, мышиный рекомбинантный проММП-9 (105 кДа) и ТИМП-1 (28 кДа) загружали в лунки того же геля для обеспечения средств количественной оценки. После SDS-PAGE и переноса мембрану разрезали по горизонтали, и верхнюю порцию зондировали антителом против мышиного MMP-9, тогда как нижнюю порцию зондировали антителом против TIMP-1. Положение маркеров молекулярной массы указано слева. (C) Ангиогенная способность мышиных макрофагов M2 зависит от экспрессии MMP-9.Интактные макрофаги M2, полученные из BM мышей WT или Mmp9 -KO, были включены в трехмерные коллагеновые растения и проанализированы в анализе ангиогенеза САМ. Среду SF использовали в качестве отрицательного бесклеточного (NC) контроля. Данные взяты из 2 независимых экспериментов, в каждом из которых задействовано от 4 до 6 эмбрионов, в каждом из которых находится от 5 до 6 растений. Гистограмма представляет собой средние значения ± SEM кратных изменений уровней ангиогенеза по сравнению с контролем NC (1,0). * P <0,05 и ** P <0,01 по сравнению с уровнями ангиогенеза, индуцированными макрофагами WT M2.(D) Ангиогенная способность мышиных макрофагов M2 чувствительна к TIMP-1. Макрофаги M2, полученные из BM мышей WT или Mmp9 -KO, инкубировали в среде SF в течение 48 часов. CM включали в 3-мерные коллагеновые растения отдельно или с 4 нг рекомбинантного мышиного ТИМП-1 на одно растение. Среду SF использовали в качестве отрицательного контроля. Данные взяты из 2 независимых экспериментов CAM, в каждом из которых участвует от 4 до 6 эмбрионов на вариант (5-6 растений на эмбрион). Гистограмма представляет собой средние значения ± SEM кратных изменений уровней ангиогенеза по сравнению с контролем SF (1.0). * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,0001, все в сравнении с уровнями ангиогенеза, индуцированными макрофагами WT M2.

Рисунок 7

Ангиогенный потенциал М2-макрофагов, полученных из мышиного BM, зависит от их проММП-9, не содержащего ТИМП-1. (A) Поляризация макрофагов, полученных из мышиного BM. Макрофаги M0 были получены от мышей WT (вверху) или мышей Mmp9, -KO (внизу) путем инкубации клеток ВМ в присутствии мышиного M-CSF.После 7-дневного созревания макрофаги M0 инкубировали в течение 24 часов либо в смеси IFNγ и LPS для индукции фенотипа M1, либо с IL-4 для индукции фенотипа M2. Фазово-контрастные изображения были получены с использованием микроскопа Olympus CKX-41, оснащенного видеокамерой Olympus U-LS30-3 и программой Infinity Capture, и обработаны с помощью Adobe Photoshop. Объектив, × 20. (B) Вестерн-блоттинг MMP-9 и TIMP-1, продуцируемых зрелыми и поляризованными мышиными макрофагами. После созревания и поляризации мышиные макрофаги переводили на среду SF.CM собирали через 48 часов и анализировали на продукцию MMP-9 и TIMP-1. Контрольные белки, мышиный рекомбинантный проММП-9 (105 кДа) и ТИМП-1 (28 кДа) загружали в лунки того же геля для обеспечения средств количественной оценки. После SDS-PAGE и переноса мембрану разрезали по горизонтали, и верхнюю порцию зондировали антителом против мышиного MMP-9, тогда как нижнюю порцию зондировали антителом против TIMP-1. Положение маркеров молекулярной массы указано слева. (C) Ангиогенная способность мышиных макрофагов M2 зависит от экспрессии MMP-9.Интактные макрофаги M2, полученные из BM мышей WT или Mmp9 -KO, были включены в трехмерные коллагеновые растения и проанализированы в анализе ангиогенеза САМ. Среду SF использовали в качестве отрицательного бесклеточного (NC) контроля. Данные взяты из 2 независимых экспериментов, в каждом из которых задействовано от 4 до 6 эмбрионов, в каждом из которых находится от 5 до 6 растений. Гистограмма представляет собой средние значения ± SEM кратных изменений уровней ангиогенеза по сравнению с контролем NC (1,0). * P <0,05 и ** P <0,01 по сравнению с уровнями ангиогенеза, индуцированными макрофагами WT M2.(D) Ангиогенная способность мышиных макрофагов M2 чувствительна к TIMP-1. Макрофаги M2, полученные из BM мышей WT или Mmp9 -KO, инкубировали в среде SF в течение 48 часов. CM включали в 3-мерные коллагеновые растения отдельно или с 4 нг рекомбинантного мышиного ТИМП-1 на одно растение. Среду SF использовали в качестве отрицательного контроля. Данные взяты из 2 независимых экспериментов CAM, в каждом из которых участвует от 4 до 6 эмбрионов на вариант (5-6 растений на эмбрион). Гистограмма представляет собой средние значения ± SEM кратных изменений уровней ангиогенеза по сравнению с контролем SF (1.0). * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,0001, все в сравнении с уровнями ангиогенеза, индуцированными макрофагами WT M2.

После этих подтверждающих характеристик мы проанализировали уровни экспрессии проММП-9 и ТИМП-1 в различных типах мышиных макрофагов. Вестерн-блоттинг документально подтвердил отсутствие продукции MMP-9 каким-либо из макрофагов Mmp9 -KO и показал, что макрофаги WT продуцируют аналогичные уровни proMMP-9 независимо от их фенотипической идентичности (фигура 7B, верхняя часть).Важно отметить, что поляризация M2 привела к почти полной потере секреции TIMP-1, независимо от генетического статуса мышиных макрофагов Mmp9 (фигура 7B, ниже).

Затем мы сравнили in vivo ангиогенный потенциал макрофагов WT и Mmp9 -KO M2. Подтверждая принцип, ангиогенный потенциал макрофагов M2 зависел от их статуса Mmp9 . Таким образом, генетический недостаток MMP-9 был связан с 2.4-кратное снижение ангиогенной активности макрофагов Mmp9 -KO M2 по сравнению с аналогами дикого типа (фигура 7C). Аналогичная 2,7-кратная разница в ангиогенной активности наблюдалась также между CM от WT и макрофагами Mmp9- KO M2 (фигура 7D). Важно отметить, что высокий ангиогенный потенциал CM из макрофагов WT M2 был чувствителен к добавлению экзогенного мышиного TIMP-1, что дополнительно указывает на то, что ферментативная активность MMP-9 была необходима и ответственна за основную часть ангиогенной индукции (фигура 7D).Демонстрируя отсутствие неспецифических негативных эффектов, низкие уровни ангиогенеза, индуцированного макрофагами Mmp9 -KO M2, не были затронуты экзогенным TIMP-1.

Начальное ангиогенное переключение часто требует притока зрелых нейтрофилов, которые высвобождают свой секреторный груз, содержащий высокоангиогенный проММП-9. 24,28 Поскольку в природе не содержится ТИМП-1 в комплексе, 33,48 нейтрофилов proMMP-9 быстро активируется в мощный протеолитический фермент, высвобождающий прямые ангиогенные факторы, такие как фактор роста эндотелия сосудов и FGF-2, секвестрированный в внеклеточный матрикс. 31,34 Начальный приток нейтрофилов 24 сопровождается инфильтрацией моноцитами периферической крови и миелоидными клетками BM, которые дифференцируются в различные субпопуляции тканевых макрофагов, включая макрофаги M1 и M2. 4,8 Предполагаемая роль ТАМ как миелоидных клеток, доставляющих проангиогенный проММР-9, широко известна, 16,17,36,37,49 , но секреция отчетливо ангиогенного проММП-9 не связана конкретно с опухолью. -продвижение макрофагов М2.Следовательно, цель этого исследования состояла в том, чтобы определить точный фенотип макрофагов, происходящих из моноцитов человека, который способен индуцировать высокие уровни ангиогенеза в зависимости от proMMP-9. Мы сравнили способность предшественников клеток макрофагов (моноцитов) индуцировать ангиогенез, их дифференцированных потомков (зрелые макрофаги M0) и их поляризованных потомков (макрофаги M1 и M2) и распространили наши результаты на макрофаги, полученные из мышиного BM.

В анализах ангиогенеза in vivo, используемых в этом исследовании, неоваскуляризация критически зависит от начального добавления проММР-9 или его доставки за счет притока воспалительных клеток в растения у куриных эмбрионов и ангиотрубок у мышей. 25,28,34 Таким образом, эти модели живых животных были специально выбраны для количественной оценки ангиогенной способности моноцитарных клеток по отношению к продуцируемой ими проММР-9, молекуле, которая долгое время была тесно связана с индукцией ангиогенеза. 50 Мы продемонстрировали, что макрофаги M2 человека действительно представляют собой тип моноцитарных клеток, который наиболее способен индуцировать уровни ангиогенеза, сравнимые с уровнями, индуцированными высокоангиогенными нейтрофилами, тогда как зрелые макрофаги M0 и поляризованные M1 макрофаги гораздо менее ангиогенны.Важно отметить, что истощение аффинности ММР-9 у клеточного CM указывает на то, что основная способность индуцировать ангиогенез всех протестированных макрофагов содержится в их секретируемом проММР-9. Кроме того, ингибирующие эффекты уникального блокирующего функцию mAb 7-11C показали, что, подобно нейтрофильному proMMP-9, зимоген MMP-9, продуцируемый макрофагами M2, требует активации для проявления его способности индуцировать ангиогенез у живых животных.

В соответствии с зависимостью наших анализов ангиогенеза in vivo от proMMP-9, моноциты периферической крови, секретирующие мало, если вообще какие-либо proMMP-9, почти не проявляли ангиогенной способности.Зрелые и поляризованные макрофаги, продуцирующие повышенные количества проММР-9 по сравнению с моноцитами, демонстрировали существенно разные уровни ангиогенеза, даже если их проММП-9 поставлялся в равных количествах интактными клетками внутри КМ или в виде очищенного зимогена. Естественное комплексообразование с ТИМП-1 представляет собой альтернативный сценарий для подтверждения низкого ангиогенного потенциала проММП-9, продуцируемого макрофагами М0 и М1. Несколько биохимических исследований продемонстрировали, что отягощение проММП-9 ТИМП-1 отрицательно влияет на активацию зимогена и снижает протеолитическую активность активированного фермента. 31-34 Используя модели живых животных, мы показали, что комплексообразование ТИМП-1 с нейтрофилом проММП-9 в конечном итоге отменяет индукцию физиологического и патологического ангиогенеза. 28,31,34 Здесь количественный анализ проММП-9, очищенного из различных типов моноцитарных клеток, подтвердил, что высокоангиогенные макрофаги М2 имеют самые низкие уровни ТИМП-1 в комплексе с их проММП-9. Напротив, близкие к стехиометрическому уровню уровни ТИМП-1 естественным образом образуют комплекс с проММП-9, который секретируется низкоангиогенными макрофагами М0 и М1, которые при опосредованном siRNA подавлении ТИМП-1 становятся ангиогенными, что согласуется с зависимостью ангиогенеза от ТИМП. -свободный статус проММП-9.И наоборот, индуцированное IL-4 подавление экспрессии TIMP1 в низкоангиогенных M0 макрофагах делает полученные M2-поляризованные макрофаги ангиогенной способностью, что теперь может быть отнесено к TIMP-1-дефицитному статусу их секретируемого proMMP-9. Из-за значительного снижения продукции ТИМП-1 при поляризации М2 ≥90% молекул проММП-9, секретируемых макрофагами М2, не образуют комплексов с ТИМП-1, что делает М2 проММП-9 легко активируемым в тканевом микроокружении.

В контексте патологического микроокружения было показано, что IL-4, продуцируемый Т-лимфоцитами, усиливает протопухолевые функции ТАМ. 49 В настоящем исследовании индуцированное IL-4 отключение экспрессии TIMP-1 в M2-поляризованных макрофагах, по-видимому, зависит от клеточного клона, поскольку оно не встречается в других типах гематопоэтических клеток, представленных лейкозными клетками, промиелобластами HL-60. и гистиоциты U937 или в раковых клетках человека, таких как фибросаркома HT-1080. Это неожиданное открытие предостерегает от прямой экстраполяции наблюдений на иммортализованных клеточных линиях лейкемии непосредственно на естественные лейкоциты и их роль в ангиогенезе.Следовательно, важно, что в данном случае врожденные макрофаги, происходящие из моноцитов, использовались для поляризации, индуцированной IL-4.

Для подтверждения наших результатов, полученных с человеческими клетками, мы использовали макрофаги, полученные из мышиного BM, и продемонстрировали, что их индуцированная IL-4 поляризация M2 также приводит к резкому подавлению TIMP-1 и продукции ангиогенного TIMP-free proMMP-9. . Следовательно, наши недавно установленные биохимические механизмы, лежащие в основе специфической индукции ангиогенеза макрофагами человека, могут быть распространены на другие виды млекопитающих.Кроме того, сравнивая макрофаги M2 от мышей WT и Mmp9 -KO, мы не только напрямую связали мышиные макрофаги M2 с продуцированием отдельной индуцирующей ангиогенез ММР-9, но также продемонстрировали, что с г. Mmp9 -нулевые макрофаги M2 проявляли низкий ангиогенный потенциал, несмотря на то, что TIMP-1 подавлялся. Вместе с нашими предыдущими исследованиями нейтрофилов человека и мыши, 28,31,34 результаты настоящего исследования обеспечивают доказательство концепции о том, что механизмы, лежащие в основе ангиогенеза in vivo, критически зависят от proMMP-9, поставляемого конкретными субпопуляциями клеток, полученных из BM. .

В заключение, мы продемонстрировали существенную потребность в специфических воспалительных лейкоцитах 2 различных видов для продуцирования TIMP-1-свободного или TIMP-1-дефицитного proMMP-9 для индукции высоких уровней ангиогенеза. В терапевтических целях может быть важно изучить, будет ли переключение M2 → M1, индуцированное, например, обработкой IFNγ ТАМ, 51 , сопровождаться индукцией экспрессии TIMP-1 и продуцированием неангиогенных, обремененных TIMP-1 проММП-9.Текущие исследования в нашей лаборатории позволят нам также ответить, происходит ли подавление TIMP-1 в фактическом тканевом микроокружении во время поляризации M2 и секретируют ли альтернативно активированные макрофаги M2, например, M2-искаженные ТАМ в солидных опухолях, TIMP-1-дефицитные и высокоангиогенный проММП-9. Если это так, то специфическое цитокин-индуцированное подавление экспрессии гена TIMP-1 и выработка MMP-9, не содержащего TIMP, теперь будет представлять собой дополнительный маркер субпопуляции M2 ТАМ, ответственных за подпитку образования ангиогенных кровеносных сосудов, основных каналы распространения и метастазирования опухолевых клеток.

Онлайн-версия этой статьи содержит дополнение с данными.

Затраты на публикацию этой статьи были частично оплачены за счет оплаты страницы. Таким образом, и исключительно для того, чтобы указать на этот факт, данная статья помечена как «реклама» в соответствии с разделом 18 USC 1734.

Авторы благодарят доктора Р.Фридманом для рекомбинантных ТИМП-1 и ММП-9 человека и Dr C. В целом для рекомбинантных ТИМП-1 и ММП-9 мыши.

Это исследование было поддержано Национальными институтами здравоохранения, Национальным институтом рака, грантами R01CA157792 и R01CA105412, а также грантом Института трансляционных исследований Скриппса UL1 TR000109-05 Pilot 2.2.284R1 (для JPQ и EID), исследовательского приложения к R01CA105412 от Национальных институтов здравоохранения. Программа поощрения разнообразия в исследованиях, связанных со здоровьем (на Э.Z.), а также стипендии от Фонда Макса Кейда (для B.S.), Фондов Лундбека и Уиллума Канна Расмуссена (для A.J.-J.) и Швейцарского национального научного фонда для перспективных исследований (для P.M.).

Это рукопись № 24036 от ЦНИИ.

Вклад: E.Z. выполнил большинство включенных экспериментов, проанализировал данные и способствовал написанию статьи; Б.S. первоначально наблюдал уменьшение белка TIMP-1 на поляризации макрофагов M2 и провел важные начальные эксперименты; T.A.K. провели морфологический анализ изолированных клеток и культивированных макрофагов; А.Дж.-Дж. провели анализ экспрессии генов макрофагов; ВЕЧЕРА. провели анализ экспрессии генов и вестерн-блоттинг; J.P.Q. инициировал и разработал проект, интерпретировал результаты и написал рукопись; и E.I.D. также инициировал и разработал проект, предоставил необходимые знания на моделях живых животных, интерпретировал результаты и написал рукопись.

Раскрытие информации о конфликте интересов: авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Текущая принадлежность B.S. является кафедрой дерматологии Венского медицинского университета, Вена, Австрия.

Для корреспонденции: Елена И. Дерюгина, Отдел клеточной и молекулярной биологии, Научно-исследовательский институт Скриппса, 10550 North Torrey Pines Rd, SP3030-3120, La Jolla, CA 92037; e-mail: deryugin @ scripps.edu; и Джеймс П. Куигли, отдел клеточной и молекулярной биологии, Исследовательский институт Скриппса, 10550 North Torrey Pines Rd, SP3030-3120, La Jolla, CA 92037; электронная почта: [email protected]

Циклическая гипоксия способствует провоспалительному фенотипу в макрофагах через сигнальный путь JNK / p65

  • 1.

    Ханахан Д. и Вайнберг Р. А. Признаки рака. Cell 100 , 57–70 (2000).

    CAS Статья Google ученый

  • 2.

    Junttila, M. R. & de Sauvage, F. J. Влияние неоднородности микросреды опухоли на терапевтический ответ. Nature 501 , 346–354, https://doi.org/10.1038/nature12626 (2013).

    ADS CAS Статья PubMed Google ученый

  • 3.

    Спан, П. Н., Бассинк, Дж. Биология гипоксии. Семинары по ядерной медицине 45 , 101–109, https://doi.org/10.1053/j.semnuclmed.2014.10.002 (2015).

    Артикул PubMed Google ученый

  • 4.

    Кармелиет П. и Джейн Р. К. Ангиогенез при раке и других заболеваниях. Nature 407 , 249–257, https://doi.org/10.1038/35025220 (2000).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 5.

    Томлинсон Р. Х. и Грей Л. Х. Гистологическая структура некоторых видов рака легких человека и возможные последствия для лучевой терапии. Британский журнал рака 9 , 539–549 (1955).

    CAS Статья Google ученый

  • 6.

    Браун, Дж. М. Доказательства острой гипоксии клеток в опухолях мышей и возможный механизм реоксигенации. Британский радиологический журнал 52 , 650–656 (1979).

    CAS Статья Google ученый

  • 7.

    Браун, Дж.M. & Giaccia, A.J. Уникальная физиология солидных опухолей: возможности (и проблемы) для лечения рака. Онкологические исследования 58 , 1408–1416 (1998).

    CAS PubMed Google ученый

  • 8.

    Макдональд, Д. М. и Чойк, П. Л. Визуализация ангиогенеза: от микроскопа до клиники. Природная медицина 9 , 713–725, https://doi.org/10.1038/nm0603-713 (2003).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 9.

    Дьюхерст, M. W. Прерывистая гипоксия служит основанием для нацеливания на индуцируемый гипоксией фактор-1. Cancer Res 67 , 854–855, https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-06-4744 (2007).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 10.

    Tellier, C. et al. . Циклическая гипоксия индуцирует специфический усиленный воспалительный фенотип в эндотелиальных клетках и усиливает опухолевое воспаление in vivo . Неоплазия 17 , 66–78, https://doi.org/10.1016/j.neo.2014.11.003 (2015).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 11.

    Колотта, Ф., Аллавена, П., Сика, А., Гарланда, С. и Мантовани, А. Воспаление, связанное с раком, седьмой признак рака: связь с генетической нестабильностью. Канцерогенез 30 , 1073–1081, https://doi.org/10.1093/carcin/bgp127 (2009).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 12.

    Ханахан Д. и Вайнберг Р. А. Признаки рака: следующее поколение. Cell 144 , 646–674, https://doi.org/10.1016/j.cell.2011.02.013 (2011).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 13.

    Дворжак, Х. Ф. Опухоли: незаживающие раны. Сходства между образованием стромы опухоли и заживлением ран. Медицинский журнал Новой Англии 315 , 1650–1659, https://doi.org/10.1056/NEJM198612253152606 (1986).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 14.

    Бингл, Л., Браун, Н. Дж. И Льюис, К. Э. Роль связанных с опухолью макрофагов в прогрессировании опухоли: значение для новых противоопухолевых методов лечения. Патологический журнал 196 , 254–265, https://doi.org/10.1002 / путь.1027 (2002).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 15.

    Моссер, Д. М. и Эдвардс, Дж. П. Изучение полного спектра активации макрофагов. Природные обзоры. Иммунология 8 , 958–969, https://doi.org/10.1038/nri2448 (2008).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 16.

    Мантовани, А., Соццани, С., Локати, М., Аллавена, П. и Сика, А. Поляризация макрофагов: ассоциированные с опухолью макрофаги как парадигма поляризованных мононуклеарных фагоцитов M2. Тенденции в иммунологии 23 , 549–555 (2002).

    CAS Статья Google ученый

  • 17.

    Мантовани А., Бисвас С. К., Галдьеро М. Р., Сика А. и Локати М. Пластичность и поляризация макрофагов при восстановлении и ремоделировании тканей. Патологический журнал 229 , 176–185, https: // doi.org / 10.1002 / path.4133 (2013).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 18.

    Моссер Д. М. Многоликая активация макрофагов. Журнал биологии лейкоцитов 73 , 209–212 (2003).

    CAS Статья Google ученый

  • 19.

    Льюис, К. Э. и Поллард, Дж. У. Особая роль макрофагов в различных микроокружениях опухолей. Исследования рака 66 , 605–612, https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-05-4005 (2006).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 20.

    Руффелл Б., Аффара Н. И. и Кусенс Л. М. Дифференциальное программирование макрофагов в микросреде опухоли. Тенденции в иммунологии 33 , 119–126, https://doi.org/10.1016/j.it.2011.12.001 (2012).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 21.

    Genard, G. и др. . Облучение протонами управляет перепрограммированием макрофагов посредством передачи сигналов NFkappaB. Cell Death Dis 9 , 728, https://doi.org/10.1038/s41419-018-0757-9 (2018).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 22.

    Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M. & Michiels, C. Макрофаги M1 и M2, полученные из клеток THP-1, по-разному модулируют ответ раковых клеток на этопозид. BMC Cancer 15 , 577, https://doi.org/10.1186/s12885-015-1546-9 (2015).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 23.

    Cheadle, W. G. Антигены лейкоцитов человека и их связь с инфекцией. Am J Surg 165 , 75S-81S (1993).

    CAS Статья Google ученый

  • 24.

    Шарп А. Х. и Фриман Г. Дж. Суперсемейство B7-CD28. Nat Rev Immunol 2 , 116–126, https://doi.org/10.1038/nri727 (2002).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 25.

    Pichlmair, A. et al. . IFIT1 — это противовирусный белок, распознающий 5′-трифосфатную РНК. Природная иммунология 12 , 624–630, https://doi.org/10.1038/ni.2048 (2011).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 26.

    Пиро, В. и др. . Окисленные миелопероксидазой ЛПНП усиливают противовоспалительный M2 и антиоксидантный фенотип в макрофагах мышей. Медиаторы Inflamm 2016 , 8249476, https://doi.org/10.1155/2016/8249476 (2016).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 27.

    Лю, Ю. К., Цзоу, X. Б., Чай, Ю. Ф. и Яо, Ю. М. Поляризация макрофагов при воспалительных заболеваниях. Международный журнал биологических наук 10 , 520–529, https://doi.org/10.7150/ijbs.8879 (2014).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 28.

    Singhal, S. et al. . Человеческие опухолевые моноциты / макрофаги и их регуляция Т-клеточного ответа при ранней стадии рака легкого. Sci Transl Med , 11 , https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aat1500 (2019).

    CAS Статья Google ученый

  • 29.

    Sica, A. & Mantovani, A. Пластичность и поляризация макрофагов: in vivo, veritas. J Clin Invest 122 , 787–795, https://doi.org/10.1172/JCI59643 (2012).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 30.

    Чанми, Т., Онтонг, П., Конно, К. и Итано, Н. Макрофаги, ассоциированные с опухолью, как основные игроки в микросреде опухоли. Cancers (Базель) 6 , 1670–1690, https://doi.org/10.3390/cancers6031670 (2014).

    CAS Статья Google ученый

  • 31.

    Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L. & Allavena, P. Макрофаги, связанные с опухолями, как мишени для лечения в онкологии. Nat Rev Clin Oncol 14 , 399–416, https: // doi.org / 10.1038 / nrclinonc.2016.217 (2017).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 32.

    Альмендрос, И. и др. . Прерывистые индуцированные гипоксией изменения в макрофагах, связанных с опухолью, и злокачественные новообразования в мышиной модели апноэ во сне. Am J Respir Crit Care Med 189 , 593–601, https://doi.org/10.1164/rccm.201310-1830OC (2014).

    Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

  • 33.

    Льюис, Дж. С., Ли, Дж. А., Андервуд, Дж. К., Харрис, А. Л. и Льюис, К. Е. Ответы макрофагов на гипоксию: отношение к механизмам заболевания. J Leukoc Biol 66 , 889–900, https://doi.org/10.1002/jlb.66.6.889 (1999).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 34.

    Элгерт, К. Д., Аллева, Д. Г. и Маллинс, Д. В. Опухоль-индуцированная иммунная дисфункция: связь макрофагов. J Leukoc Biol 64 , 275–290 (1998).

    CAS Статья Google ученый

  • 35.

    Войтович-Прага, С. Обращение вызванной опухолью иммуносупрессии: новый подход к терапии рака. J Immunother 20 , 165–177 (1997).

    CAS Статья Google ученый

  • 36.

    Nakao, S. et al. . Инфильтрация макрофагов, экспрессирующих ЦОГ-2, является предпосылкой для индуцированной IL-1 бета неоваскуляризации и роста опухоли. J Clin Invest 115 , 2979–2991, https://doi.org/10.1172/JCI23298 (2005).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 37.

    Baudelet, C. et al. . Роль созревания и функциональности сосудов в спонтанных колебаниях T2 * -взвешенного сигнала GRE в опухолях. ЯМР в биомедицине 19 , 69–76, https://doi.org/10.1002/nbm.1002 (2006).

    Артикул PubMed Google ученый

  • 38.

    Муз, Б., де ла Пуэнте, П., Азаб, Ф. и Азаб, А. К. Роль гипоксии в прогрессировании рака, ангиогенезе, метастазировании и устойчивости к терапии. Гипоксия (Окл) 3 , 83–92, https://doi.org/10.2147/HP.S93413 (2015).

    Артикул Google ученый

  • 39.

    Martinive, P. et al. .Прекондиционирование сосудистой сети опухоли и опухолевых клеток перемежающейся гипоксией: последствия для противоопухолевой терапии. Исследования рака 66 , 11736–11744, https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-06-2056 (2006).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 40.

    Toffoli, S., Feron, O., Raes, M. & Michiels, C. Прерывистая гипоксия изменяет паттерн фосфорилирования HIF-1alpha в эндотелиальных клетках: раскрытие новой PKA-зависимой регуляции HIF-1alpha. Biochimica et biophysica acta 1773 , 1558–1571, https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2007.06.002 (2007).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 41.

    Martinive, P. et al. . Влияние циклической гипоксии на регуляцию HIF-1альфа в эндотелиальных клетках — новые идеи для противоопухолевого лечения. Журнал FEBS 276 , 509–518, https://doi.org/10.1111/j.1742-4658.2008.06798.x (2009 г.).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 42.

    Toffoli, S. et al. . Прерывистая гипоксия является индуктором ангиогенеза эндотелиальных клеток: роль HIF-1. Ангиогенез 12 , 47–67, https://doi.org/10.1007/s10456-009-9131-y (2009).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 43.

    Дано, Г., Boidot, R., Martinive, P. & Feron, O. Идентификация циклооксигеназы-2 как основного участника транскриптомной адаптации эндотелиальных и опухолевых клеток к циклической гипоксии: влияние на ангиогенез и метастазы. Клинические исследования рака: официальный журнал Американской ассоциации исследований рака 16 , 410–419, https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-09-0583 (2010).

    CAS Статья Google ученый

  • 44.

    Джин, Х. и др. . Конечные продукты с улучшенным гликированием усиливают поляризацию макрофагов в фенотип M1 за счет активации пути RAGE / NF-kappaB. Biomed Res Int 2015 , 732450, https://doi.org/10.1155/2015/732450 (2015).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 45.

    Wu, X. et al. . Активация HMGB1 как фактора прогрессирования воспалительного ответа в нормальных эпителиальных клетках бронхов человека посредством пути RAGE / JNK / NF-kappaB. Mol Cell Biochem 380 , 249–257, https://doi.org/10.1007/s11010-013-1680-0 (2013).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 46.

    Карро, А., Эль-Хафни-Рахби, Б., Матеджук, А., Грильон, К. и Киеда, С. Почему парциальное давление кислорода в тканях человека является решающим параметром? Малые молекулы и гипоксия. J Cell Mol Med 15 , 1239–1253, https://doi.org/10.1111/j.1582-4934.2011.01258.x (2011).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 47.

    Хуньер И. и Кук К. М. Модели перемежающейся гипоксии и обструктивного апноэ во сне: молекулярные пути и их вклад в развитие рака. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 315 , R669 – R687, https://doi.org/10.1152/ajpregu.00036.2018 (2018).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 48.

    Спиллер, К. Л. и др. . Дифференциальная экспрессия генов в макрофагах человека, мыши и клеточных линий при поляризации. Exp Cell Res 347 , 1–13, https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2015.10.017 (2016).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 49.

    Chanput, W., Mes, J. J. & Wichers, H. J. Клеточная линия THP-1: модель in vitro клеток для подхода иммуномодуляции. Int Immunopharmacol 23 , 37–45, https://doi.org/10.1016/j.intimp.2014.08.002 (2014).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 50.

    Шариф, О., Большаков, В. Н., Рейнс, С., Ньюхэм, П. и Перкинс, Н. Д. Транскрипционное профилирование LPS-индуцированного ответа NF-kappaB в макрофагах. BMC Immunol 8 , 1, https://doi.org/10.1186/1471-2172-8-1 (2007).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 51.

    Rofstad, E. K., Gaustad, J. V., Egeland, T. A., Mathiesen, B. & Galappathi, K. Опухоли, подвергшиеся острому циклическому гипоксическому стрессу, демонстрируют усиленный ангиогенез, перфузию и метастатическое распространение. Международный журнал рака. Международный журнал рака 127 , 1535–1546, https://doi.org/10.1002/ijc.25176 (2010).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 52.

    Рофстад, Э. К., Галаппати, К., Mathiesen, B. & Ruud, E. B. Колеблющаяся и ограниченная диффузией гипоксия при метастазах, вызванных гипоксией. Клинические исследования рака: официальный журнал Американской ассоциации исследований рака 13 , 1971–1978, https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-06-1967 (2007).

    CAS Статья Google ученый

  • 53.

    Кэрнс, Р. А., Каллиомаки, Т. и Хилл, Р. П. Острая (циклическая) гипоксия усиливает спонтанное метастазирование опухолей мышей KHT. Онкологические исследования 61 , 8903–8908 (2001).

    CAS PubMed Google ученый

  • 54.

    Кэрнс, Р. А. и Хилл, Р. П. Острая гипоксия усиливает спонтанное метастазирование в лимфатические узлы в ортотопической модели рака шейки матки человека на мышах.

  • Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *